Определение относительной силы из анти-ФНО моноклональных антител (МАБ), Neutralizing ФНО, с помощью метода Биоаналитические In Vitro
Summary
Здесь представлены протокол для определения относительной анти apoptotic активности анти TNFα МАБ, с помощью механизма нейтрализации с WEHI 164 клеток. Этот протокол полезно для сравнения нейтрализации прочности различных молекул с той же биологической функциональности.
Abstract
Этот протокол показывает измерение нейтрализации деятельности apoptotic TNFα мыши модели клетки фибробластов (WEHI 164) с помощью анти TNFα МАБ. Кроме того этот протокол может использоваться для оценки других анти TNFα молекул, таких как синтез белков. Сотовая модель, работающих здесь чувствителен к TNFα-опосредованной апоптоза, когда дополнительный стресс-фактор индуцируется в условиях культуры клеток (например, лишение сыворотки). Эта процедура является примером того, как выполнить этот аналитический assay, подчеркнув основные операции, относящиеся к пробоподготовки, клетки разрежения, индукции апоптоза и спектрофотометрические измерения, которые имеют решающее значение для обеспечения успешных результатов. Этот протокол показывает лучшее исполнение условий, касающихся индукции апоптоза и эффективный сигнал записи, что приводит к низкой неопределенности значений.
Introduction
Биологическая потенции является количественная мера биологической активности на основе атрибутов Оксиметрический анализ продукта, которые связаны с соответствующими биологическими свойствами, тогда как количество (выраженное в массе) — физико-химические измерения содержания белка. Потенция испытания, наряду с другой аналитической методологии, выполняются как часть соответствия продукции, стабильности и сопоставимости исследований. В этом смысле потенции измерения используются для демонстрации продукта пакеты удовлетворения критических качества атрибутов (CQAs) или критерии приемки на всех этапах клинических испытаний и после утверждения рынка.
Apoptosis запрограммированная смерть клетки, естественно происходит когда клетки заражены вирусом или когда клетки подчеркнули экологической фактор что компромиссы клеточной жизнеспособности и функция1,2. Среди прочего ингибирование апоптоза, или биологического обезвреживания, является одним из главным образом известные терапевтические механизмы mAbs, особенно в лечении хронических заболеваний, таких как воспалительные заболевания иммунной системы. Анти-TNFα молекул прилагать свои лечебные свойства, блокируя взаимодействие фактора некроза опухоли альфа (TNFα) с p55 и Р75 клеток поверхности рецепторы3, таким образом предотвращая пути сигнала, которые в итоге привести к сотовой апоптоз.
TNFα могут производить воспаления в некоторых хронических заболеваний4. Ложный TNFα выделяется во внеклеточных среды макрофагами, которые являются часовых иммунной системы и основных субъектов в такого рода заболевания5. Как общий путь TNFα дерегулирование ассоциируется с патогенез этих болезней. Без контроля и под постоянным индукции и клетки стресс TNFα индуцирует смерти и тканей дегенерация клетки, в конечном счете приводит к ревматоидный артрит, болезнь Крона и другие патологические профили6.
Антагонисты ФНО, которые блокируют взаимодействие между ФНО и его рецепторов все чаще используются в качестве эффективной терапии для снижения симптоматики и препятствовать прогрессирование этих заболеваний. В настоящее время анти TNFα наркотиков продукты широко используются для управления системного концентрация этого цитокина, таким образом предотвращая дальнейшее дегенерацию связанные тканей. В этом смысле обеспечивая воспроизводимость и надежные биопроб для описания конкретных способность препарата для достижения его биологического эффекта является императивом.
В этом протоколе, критические шаги определены в ходе разработки нейтрализации пробирного-для успешного измерения биологических потенции выделяются, с особым упором на развитие навыков, необходимых для выполнения био аналитического метода. Этот био аналитический метод обеспечивает полезные сопоставимости информации между различными партиями или анти TNFα лекарственных средств по сравнению с клинически проверенных ссылка вещество.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта характеристика позволяет определить априори биологическое поведение молекулы стадии разработки прежде чем дорогим и трудоемким клинические испытания проводятся. Это также полезно для выпуска партии партии утвержденный препарат. Стоит отметить, что эти анализы являются пол?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национального Совета по науке и технике (КОНАСИТ), Мексика Грант PEI КОНАСИТ 2015 220333, без участия в разработке исследования.
Materials
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. . Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
