Fastsettelse av den Relative styrken av en Anti-TNF monoklonalt antistoff (mAb) av Neutralizing TNF bruker en I Vitro Bioanalytical metode

Summary

En protokoll for fastsettelse av relativ anti-apoptotisk aktiviteten til en anti-TNFα mAb en nøytralisering mekanisme med WEHI 164 celler er presentert her. Denne protokollen er nyttige for sammenligning nøytralisering styrken av ulike molekyler med samme biologiske funksjonalitet.

Abstract

Denne protokollen viser måling av apoptotisk aktivitet nøytralisering av TNFα i en mus fibroblast celle modell (WEHI 164) bruker en anti-TNFα mAb. I tillegg kan denne protokollen brukes til å vurdere andre anti-TNFα molekyler, som fusion proteiner. Mobilnettet modellen ansatt her er følsom for TNFα-mediert apoptose når en ekstra stressfaktor er indusert i celle kultur forhold (f.eks serum deprivasjon). Denne prosedyren eksemplifiserer hvordan du skal utføre denne analytisk analysen, utheving nøkkeloperasjoner knyttet til eksempel forberedelse, celle fortynning, apoptose induksjon og Spektrofotometri målinger som er avgjørende for å sikre vellykket resultater. Denne protokollen avslører de beste ytelse forholdene knyttet til apoptose induksjon og effektivt signal innspilling, fører til lav usikkerhet verdier.

Introduction

Biologiske styrke er kvantitative mål på biologiske aktivitet basert på de assayed produkt-attributtene som er knyttet til de relevante biologiske egenskapene, mens antallet (uttrykt i massen) er en mekanisk-måling av proteininnhold. Styrke tester, sammen med andre analytiske metoder, utføres som en del av produktet samsvar, stabilitet og sammenliknbarhet studier. I denne forstand, styrke mål som skal brukes til å vise at produktet grupper møte kritiske kvalitet attributtene (CQAs) eller akseptkriterier under alle faser av kliniske studier og etter markedet godkjenning.

Apoptose-programmert celledød, naturlig forekommende når celler er infisert med et virus, eller når cellene er stresset av et miljømessig faktor at kompromisser mobilnettet levedyktighet og funksjonen^1,2. Blant annet er apoptose hemming, eller biologiske nøytralisering, en av de hovedsakelig kjent terapeutisk mekanismene av mAbs, spesielt i behandling av kroniske sykdommer, som immun-mediert inflammatoriske lidelser. Anti-TNFα molekyler utøve sitt terapeutiske egenskaper ved å blokkere samspillet av tumor nekrose faktor alpha (TNFα) med p55 og p75 celle overflate reseptorer³, dermed hindre signal trasé som til slutt fører til mobilnettet apoptose.

TNFα kan produsere betennelser i noen kroniske sykdommer⁴. TNFα utskilles spuriously i ekstracellulære miljøet av makrofager, som vaktposter det medfødte immunsystemet og de viktigste aktørene i denne typen sykdom⁵. Som en felles bane er TNFα dereguleringen forbundet med patogenesen av disse sykdommene. Uten kontroll og under konstant induksjon og celle stress induserer TNFα celle død og vev degenerasjon, slutt fører til revmatoid artritt, Crohns sykdom og andre patologisk profiler⁶.

TNF-antagonister som blokkerer samspillet mellom TNF og dens reseptorer har blitt stadig mer brukt som en effektiv terapi å redusere symptomer og hindre utviklingen av disse sykdommene. I dag, er anti-TNFα legemidler mye brukt til å kontrollere systemisk konsentrasjonen av denne cytokin, dermed hindre ytterligere degenerasjon av involvert vev. I denne forstand er å gi en reproduserbar og robust bioassay for å beskrive spesifikke evnen til et stoff å oppnå den biologiske effekten viktig.

I denne protokollen, kritisk trinn-identifisert under utviklingen av en nøytralisering analysen-for vellykket måling av biologiske styrke er uthevet, med særlig vekt på ferdigheter nødvendig for å utføre bio-analytiske metoden. Denne bio-analytiske metoden gir nyttig sammenlignbarhet informasjon mellom forskjellige bunker eller anti-TNFα legemidler sammenlignet med et klinisk testet referanse stoff.

Protocol

1. forberedelse av Media og løsninger forberede kultur medium: RPMI-1640 med 10% FBS, pH 7.4. Forberede analysen kultur medium: RPMI-1640 uten fenol rød, men med 1% FBS, pH 7.4. Forberede celle vaskeløsning: DPBS Mg – og Ca-free løsning med 0,02% EDTA, pH 7.4. Forberede celle avdeling løsning: 0,125% trypsin med 1 mM EDTA. Tine 100 mL en 0.25% løsning av trypsin-EDTA og overføre til en steri…

Representative Results

Dose-respons grafen (med kontroller) Figur 1 representerer luminescence svaret versus mAb konsentrasjon. Denne sigmoidal funksjonen eksemplifiserer caspase 3 og 7 utgivelsen i analysen kultur medium på grunn av cellen lysis. Celledød forsterkes av serum sult pluss TNFα signalering induksjon. Derfor samhandler anti-TNFα molekylet (mAb) med cytokin, begrenser (ved steric hindring) dets interaksjon med TNF celle reseptor. Dette fører ti…

Discussion

Denne karakteristikken bidrar til å bestemme en priori . biologisk atferd av et molekyl under utvikling før dyre og tidkrevende kliniske studier er utført. Det er også nyttig for parti til parti utgivelsen av en godkjent stoffet produkt. Det er verdt å nevne at disse analyser er nyttig for å avgjøre om et molekyl har en tilstrekkelig biologisk effekt om sin virkningsmekanismen. Bio-analytiske metoden presentert i denne opplæringen er kritisk viktig til sammenligning av ulike anti-TNFα molekyler. Mekanis…

Materials

WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Fibrosarcoma cells from Mus musculus
RPMI-1640 Medium	ATCC	30-2001	Store medium at 2 °C to 8 °C
RPMI 1640 Medium, no phenol red	GIBCO	11835-030	Store medium at 2 °C to 8 °C
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red	GIBCO	25200-056	Store medium at -10 °C to -20 °C
DPBS, no calcium, no magnesium	GIBCO	14190-136	Store medium at 2 °C to 8 °C
Recombinant Human TNF-alpha Protein	R&D Systems	210-TA-020	Store at -20 °C to -70 °C
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG	HyClone	SH3089803	Store at -10 °C to -20 °C
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	HyClone	SH3007103	Store at -10 °C to -20 °C
Caspase-Glo 3/7 Assay kit	Promega	G8093	Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent	J.T.Baker	8993-01	—
Sample mAb Adalimumab	Probiomed	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Reference and Control mAb Adalimumab	Abbvie	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536	SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate reader Software	Molecular Devices	—	SoftMax Pro 6.3 GxP
Incubator	Revco	30482	Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2
Laminar Flow Hood	The Baker Company	200256	Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2