Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance
Summary
Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les vaisseaux sanguins formation in vivo et en temps réel en 3D échafaudages par microscopie multiphoton. L’angiogenèse dans les échafaudages génétiquement modifiés a été étudiée dans un modèle de défaut murine substance osseuse critique. Plus de nouveaux vaisseaux ont été détectés dans le groupe de traitement que chez les témoins.
Abstract
La reconstruction des défauts osseux taille critique reste un problème clinique grave en raison de la mauvaise angiogenèse dans les échafaudages tissulaire lors de la réparation, ce qui donne lieu à un manque d’approvisionnement suffisant en sang et provoque des nécroses des tissus nouveaux. La vascularisation rapide est une condition sine qua non pour la survie de tissus nouveaux et l’intégration avec les tissus de l’hôte. La génération de novo du système vasculaire dans les échafaudages est l’une des étapes plus importantes dans la fabrication de la régénération osseuse plus efficace, permettant de réparer les tissus à se transformer en un échafaudage. Pour résoudre ce problème, la modification génétique d’un échafaudage de biomatériau est utilisée pour accélérer l’angiogenèse et l’ostéogenèse. Cependant, la visualisation et suivi en vivo formation de vaisseaux sanguins en temps réel et en trois dimensions (3D) échafaudages ou nouveau tissu osseux est toujours un obstacle pour l’ingénierie tissulaire osseuse. La microscopie multiphoton (MPM) est une nouvelle modalité de bio-imagerie qui peut acquérir des données volumétriques de structures biologiques de manière à haute résolution et mini-invasive. L’objectif de cette étude était de visualiser l’angiogenèse avec la microscopie multiphoton in vivo dans un échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifié pour la réparation de défauts de substance osseuse critique. PLGA/PNVS échafaudages ont été fonctionnalisés pour la prestation continue d’un gène de pdgf-b de facteur de croissance transportant des vecteurs LENTIVIRAUX (LV –pdgfb) afin de faciliter l’angiogenèse et à améliorer la régénération osseuse. Dans un OS critique substance implantés échafaudage défaut modèle murin, les zones de vaisseaux sanguins (BVAs) dans PHp échafaudages ont été significativement plus élevées que dans les échafaudages de PH. En outre, l’expression de pdgf-b et gènes liés à l’angiogenèse, vWF et VEGFR2, augmenté proportionnellement. Plus l’analyse a indiqué que la nouvelle formation osseuse dans le PHp group a grandement amélioré par rapport aux autres groupes. À notre connaissance, c’est la première fois la microscopie multiphoton fut utilisée en ingénierie tissulaire osseuse pour enquêter sur l’angiogenèse dans un échafaudage biodégradables 3D in vivo et en temps réel.
Introduction
L’OS est un tissu très vascularisé qui continue à remodeler au cours de la durée de vie d’un individuel1. La régénération osseuse rapide et efficace des défauts grand OS résultant d’un traumatisme, non syndiqué, résection de la tumeur ou des malformations cranio-faciales est un processus physiologique complex. Les approches thérapeutiques traditionnels utilisés pour la réparation osseuse défaut incluent implantation autogreffe et allogreffe, mais leur utilisation implique plusieurs problèmes et limitations, telles que la disponibilité limitée, morbidité site donateur important, un risque élevé d’infection, et l’hôte de rejet immunitaire2,3. Cependant, les greffes osseuses artificielle offrent une alternative efficace pour pallier ces limitations. Ils peuvent être faits de matériaux biodégradables, sont faciles à être fabriquer avec une taille de pore adapté et peuvent être génétiquement modifié4,5.
Actuellement, divers tissus ingénierie échafaudages ont été employés dans le développement de l’ingénierie tissulaire osseuse6,7. Pour induire la régénération et la réparation osseuse plus efficacement, biomatériaux machiné, combinée à des facteurs de croissance ont émergé et obtenu de bons résultats8,9. Malheureusement, la courte demi-vie, activité de facile-à-perdant et supra-physiologiques dosage des facteurs de croissance de l’efficacité thérapeutique de limiter leur application clinique10. Pour résoudre ces problèmes, la livraison des gènes du facteur de croissance plutôt que de facteurs de croissance a été démontrée comme une approche efficace pour maintenir l’activité biologique pour le traitement des défauts osseux et maladies11,12. Vecteurs viraux sont prometteurs de livraison des outils pour la régénération des tissus en raison de leur haute exprimant l’efficacité13.
Parmi les facteurs de croissance, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-BB) a été choisi dans cette étude, car il est non seulement un mitogène et facteur chimiotactique pour les cellules mésenchymateuses et ostéogéniques, mais aussi un stimulant pour l’angiogenèse14,15 . Des études précliniques et cliniques antérieures ont montré que le PDGF-BB pourrait promouvoir efficacement et en toute sécurité la réparation osseuse parodontale défauts osseux16,17. Des études récentes ont révélé que PDGF-BB stimule l’angiogenèse en motivant endothelial cell migration et prolifération en vivo18,19. En outre, PDGF-BB peut également rendre des cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de se différencier en cellules endothéliales20et ce d’autres points culminants le rôle potentiel de MSCs dans la néovascularisation. Par conséquent, induisant la formation de novo de vascularisation dans les échafaudages avec PDGF-BB est une étape importante pour la réparation des tissus cultivés dans les échafaudages en ingénierie tissulaire osseuse.
La guérison osseuse défaut est un processus morphogénétiques tissu dynamique qui exige une ostéogenèse coordonnée et angiogenèse à la réparation des postes21. Néoangiogenèse dans implanté échafaudages tissulaire est une condition préalable essentielle pour l’approvisionnement des cellules avec des nutriments et l’oxygène pour la croissance et de survie et pour l’élimination des déchets métaboliques. Couramment utilisé de méthodes d’imagerie, y compris les rayons x micro-calculé tomographie (microCT), l’imagerie par résonance magnétique (IRM), microscopie électronique à balayage (SEM), tomographie à cohérence optique (OCT) et laser confocal, microscopie à balayage, sont appliquées au lieu de examen histologique pour obtenir l’angiogenèse informations22,23. Cependant, ces méthodes font face à divers obstacles à visualiser et à mesurer les neovasculature en 3D échafaudages en ingénierie tissulaire osseuse. La microscopie multiphoton (MPM) est une technique de bio-imagerie relativement nouveau qui a l’avantage de simultanément la visualisation des cellules, matrice extracellulaire et entourant les réseaux vasculaires in vivo. Il possède une capacité d’imagerie tridimensionnelle inhérente pour la pénétration des tissus profonds et provoque le photovieillissement faible. Par conséquent, au cours de la dernière décennie, MPM a gagné beaucoup d’attention dans les études biomédicales24, y compris en neurosciences, immunologie et de dynamique des cellules souches. Toutefois, il est à peine utilisé dans la recherche orthopédique.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’OS est un tissu très vascularisé avec une capacité unique pour guérir et remodeler tout au long de la durée de vie d’un individuel1en permanence. Le niveau de la vascularisation est important pour l’ostéogenèse et défaut de réparation. Vascularisation faible limite l’application large clinique tissulaire osseuse. Construction d’un OS tissulaire fortement vascularisé selon la théorie de biomimetics est devenu un outil pour la réparation des défauts osseux grand segment. Dif…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le programme de paon Shenzhen, Chine (no 110811003586331), le programme de recherche fondamentale de Shenzhen (no. JCYJ20150401150223631, no JCYJ20150401145529020 et no JCYJ20160331190714896), le Guangdong Public Research and Capacity Building programme spécial (n° 2015A020212030), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 81501893), le programme de recherche de base Major National de Chine (2013CB945503) et le Programme d’Innovation de SIAT d’excellents jeunes chercheurs (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
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