Визуализация ангиогенеза путем микроскопии Multiphoton In Vivo в генетически модифицированных 3D-PLGA/nHAp эшафот подвздошную критических ремонта дефекта кости
Summary
Здесь мы представляем протокол для визуализации сосудов образование в естественных условиях и в режиме реального времени в 3D подмостей, multiphoton микроскопии. Ангиогенез в генетически модифицированных леса был изучен в мышиных подвздошную кость критический дефект модели. Больше новых кровеносных сосудов были обнаружены в группе лечения, чем в элементах управления.
Abstract
Реконструкция критически размера костных дефектов остается серьезной проблемой клинической из-за плохой ангиогенеза в ткани инженерии леса во время ремонта, которая порождает отсутствие достаточных запасов крови и вызывает некроз новых тканей. Быстрое васкуляризации является жизненно важным условием для новой ткани выживания и интеграции с существующими ткани макроорганизма. De novo поколение сосудистую в лесов является одним из наиболее важных шагов в создании костной регенерации эффективнее, позволяя ремонта ткани расти в леске. Для решения этой проблемы, генетической модификации биоматериала лески используется для ускорения ангиогенеза и Остеогенез. Однако визуализации и отслеживания в естественных условиях формирование кровеносных сосудов в режиме реального времени и в трехмерном (3D) леса или новой костной ткани по-прежнему является препятствием для строительства костной ткани. Multiphoton микроскопии (MPM) является роман модальности био изображений, который может приобрести объемные данные из биологических структур с высоким разрешением и минимально инвазивная образом. Целью данного исследования было визуализировать ангиогенеза с multiphoton микроскопии в естественных условиях в генетически модифицированных 3D-PLGA/nHAp леску для ремонта подвздошную кость критический дефект. PLGA/nHAp леса были функционализированных для устойчивой доставки гена фактора роста pdgf-b , перевозящих лентивирусные векторы (LV –pdgfb) с целью облегчения ангиогенеза и укреплению костной регенерации. В имплантированных эшафот подвздошную кость критических дефектов модель мыши, области кровеносный сосуд (BVAs) в PHp леса были значительно выше, чем в PH подмостей. Кроме того выражение по ангиогенез связанных генов, vWF и VEGFR2и pdgf-b увеличилось соответственно. MicroCT анализ показал, что новые формирования костей в группе PHp значительно улучшились по сравнению с другими группами. Насколько нам известно это первый раз, multiphoton микроскопии был использован в костной ткани Инжиниринг расследовать ангиогенеза в 3D эшафот био разложению в естественных условиях и в режиме реального времени.
Introduction
Кости является весьма васкуляризированной ткани, которая продолжает переделывать во время существования отдельных1. Быстрое и эффективное костной регенерации больших костных дефектов в результате травмы, исправления, резекции опухоли или черепно-лицевых аномалий это сложный физиологический процесс. Традиционные терапевтические подходы, используемые для ремонта дефектов костей включают аутотрансплантатом и аллотрансплантата имплантации, но их использование предполагает некоторые проблемы и ограничения, такие, как ограниченная доступность, значительных доноров сайте заболеваемости, высокий риск инфекции, и размещать иммунной отклонение2,3. Однако искусственные костных имплантатов предлагают эффективную альтернативу для смягчения этих ограничений. Они могут быть сделаны из биоразлагаемых материалов, легко изготовить с подходящей поры и может быть генетически модифицированных4,5.
В настоящее время были использованы различные ткани инженерные строительные леса в развитии костной ткани инженерии6,7. Чтобы побудить кости ремонт и восстановление более эффективно, инженерии биоматериалов, в сочетании с факторами роста возникли и достигнутые хорошие результаты8,9. К сожалению короткий период полураспада, легко потерять активности и дозировка supraphysiological факторов роста для терапевтической эффективности ограничить их клинические приложения10. Для преодоления этих проблем, была продемонстрирована доставки генов факторов роста вместо факторы роста как эффективный подход для поддержания препараты для лечения костных дефектов и болезней11,12. Вирусных векторов являются перспективными доставки инструменты для регенерации тканей из-за их высокой, выражая эффективности13.
Среди факторов роста в этом исследовании был выбран тромбоцитарный фактор роста (PDGF-BB), потому что это не только Митоген и хемотаксического мезенхимальных и Остеогенные клетки, но и стимулятор по ангиогенез14,15 . Предыдущие доклинические и клинические исследования показали, что PDGF-BB может безопасно и эффективно содействовать кости ремонт в пародонтальных дефектов костной16,17. Недавние исследования показали, что PDGF-BB стимулирует ангиогенез, мотивирующих эндотелиальных клеток миграции и пролиферации в vivo18,19. Кроме того PDGF-BB, также могут оказывать способны дифференцироваться в эндотелиальных клеток20и это далее подчеркивается потенциальной роли MSCs в неоваскуляризации при мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Таким образом вызывая образование de novo сосудистую в леса с PDGF BB является важным шагом для ремонта ткани, превратилась в леса в кости тканевой инженерии.
Исцеление дефекта кости является динамической ткани морфогенетических процесс, который требует скоординированных остеогенез и ангиогенез на ремонт позиции21. Neoangiogenesis в имплантированных ткани инженерии леса является необходимым предварительным условием для питания клеток питательными веществами и кислородом для роста и выживания и для удаления метаболические отходы. Часто используемые методы обработки изображений, включая рентгеновские микро вычисляемые (microCT) томография, магнитно-резонансная томография (МРТ), растровая электронная микроскопия (SEM), оптическая когерентная томография (Окт) и Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, применяются вместо Гистологическое исследование для получения ангиогенеза информации22,23. Однако эти методы сталкиваются с различными препятствиями в визуализации и измерения это в 3D леса в кости тканевой инженерии. Multiphoton микроскопии (MPM) является сравнительно новым био изображения метод, который имеет явное преимущество одновременно визуализировать клетки, внеклеточная матрица, и окружающие сосудистой сети в vivo. Он обладает имманентной трехмерных изображений возможности для проникновения глубоких тканей и вызывает низкий фотоповреждения. Таким образом в течение последнего десятилетия, MPM привлекла много внимания в биомедицинские исследования24, в том числе в неврологии, иммунологии и динамики стволовых клеток. Однако это едва используется в ортопедических исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кости является весьма васкуляризированной ткани с уникальной способностью постоянно исцелить и переделывать на протяжении всей жизни отдельных1. Уровень васкуляризации имеет важное значение для ремонта остеогенез и дефект. Низкая васкуляризации ограничивает широкое кл…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано программе Павлин Шэньчжэнь, Китай (№ 110811003586331), Шэньчжэнь базовой программы исследований (No. JCYJ20150401150223631, № JCYJ20150401145529020 и No. JCYJ20160331190714896), Гуандун государственных исследований и укрепления потенциала специальной программы (№ 2015A020212030), Национальный природный науки фонд Китая (№ 81501893), программа национального майор Basic исследований Китая (2013CB945503) и СИАТ инновационной программы для отличные молодых исследователей (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
