تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الأوعية الدموية تشكيل في فيفو وفي الوقت الحقيقي في السقالات 3D بالفحص المجهري مولتيفوتون. ودرس الأوعية في السقالات المعدلة وراثيا في نموذج عيب مورين كالفاريال العظام حرجة. تم الكشف عن مزيد من الأوعية الدموية الجديدة في مجموعة العلاج من الضوابط.
Abstract
إعادة بناء تشوهات العظام الحجم حاسمة لا يزال يمثل مشكلة سريرية خطيرة بسبب ضعف الأوعية داخل هندسة الأنسجة السقالات أثناء الإصلاح، مما يؤدي إلى عدم وجود إمدادات كافية من الدم ويسبب نخر الأنسجة الجديدة. الأوعية السريع شرطا حيويا لبقاء الأنسجة الجديدة والتكامل مع أنسجة المضيف القائمة. جيل دي نوفو المفرج في السقالات واحد من أهم الخطوات في جعل تجديد العظام أكثر كفاءة، مما يسمح لإصلاح الأنسجة أن تنمو لتصبح سقالة. لمعالجة هذه المشكلة، يستخدم التعديل الوراثي سقالة مادة بيولوجية للتعجيل بالأوعية وتكون العظم. ومع ذلك، تصور وتتبع في فيفو تشكيل الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي والسقالات (3D) ثلاثي الأبعاد أو أنسجة العظام جديدة لا يزال عقبة لهندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هي طريقة بيو-تصوير رواية التي يمكن الحصول على بيانات حجمية من الهياكل البيولوجية بصورة عالية الاستبانة وكسبها. وكان الهدف من هذه الدراسة لتصور الأوعية مع الفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في سقالة 3D-بلجا/نهاب معدلة وراثيا لإصلاح العيب كالفاريال العظام الحرجة. وقد فونكتيوناليزيد السقالات بلجا/نهاب لإيصال الجين ب pdgf عامل النمو تحمل ناقلات لينتيفيرال (LV-بدجفب) تيسيرا للأوعية وتعزيز التجدد العظام مستمرة. في العظام حرجة كالفاريال مزروع سقالة عيب طراز الماوس، مجالات الأوعية الدموية (بفاس) في السقالات بي كانت أعلى بكثير من درجة الحموضة السقالات. بالإضافة إلى ذلك، زيادة التعبير عن بدجف-ب والجينات المتعلقة بالأوعية، فوف و VEGFR2، في المقابل. تحليل ميكروكت أشارت إلى أن تكوين العظام الجديدة في مجموعة بي إتش بي تحسنت بشكل كبير بالمقارنة مع المجموعات الأخرى. على حد علمنا، هذا هو أول مرة استخدمت مجهرية مولتيفوتون في هندسة الأنسجة العظام للتحقيق في الأوعية في 3D سقالة القابلة للتحلل الأحيائي في فيفو وفي الوقت الحقيقي.
Introduction
العظم هو نسيج vascularized العالية التي لا يزال تشكيلها خلال فترة حياة الفرد1. تجديد العظام السريع والفعال لتشوهات العظام الكبيرة الناجمة عن الصدمات، ونقابية، والورم ريسيكشنز، أو تشوهات الجمجمة عملية فيزيولوجية معقدة. وتشمل النهج العلاجية التقليدية المستخدمة لإصلاح عيب العظام غرس أوتوجرافت و allograft، ولكن استخدامها ينطوي على العديد من المشاكل والقيود، مثل محدودية، والاعتلال موقع كبير من المانحين، وارتفاع مخاطر العدوى، و استضافة الرفض المناعي2،3. ومع ذلك، توفر ترقيع العظام الاصطناعية بديل فعال للتخفيف من هذه القيود. أنها يمكن أن تكون مصنوعة من مواد قابلة للتحلل وسهلة لأن اختﻻق مع حجم مسام مناسبة، ويمكن أن تكون الكائنات المعدلة وراثيا4،5.
حاليا، تم توظيف السقالات هندسة الأنسجة المختلفة في تطوير هندسة الأنسجة العظام6،7. للحث على إصلاح العظام والتجديد أكثر فعالية، ظهرت الهندسة الحيوية جنبا إلى جنب مع عوامل النمو وحققت نتائج جيدة8،9. لسوء الحظ، نصف عمر قصيرة وسهلة لتفقد النشاط وجرعة سوبرافيسيولوجيكال من عوامل النمو للفعالية العلاجية الحد على التطبيق السريري10. للتغلب على هذه المشاكل، أثبت إيصال الجينات عامل النمو بدلاً من عوامل النمو كنهج فعال للحفاظ على بيواكتيفيتي لعلاج العيوب العظمى والأمراض11،12. النواقل الفيروسية إيصال واعدة أدوات لتجديد الأنسجة نتيجة عالية على التعبير عن الكفاءة13.
بين عوامل النمو، عوامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF-BB) تم اختيارها في هذه الدراسة لأنها ليس فقط mitogen وتشيمواتراكتانت لخلايا mesenchymal وأوستيوجينيك، ولكن أيضا منشط للأوعية14،15 . وأظهرت الدراسات السريرية والسريرية السابقة أن PDGF-BB يمكن تعزيز إصلاح العظام في اللثة العيوب العظمى16،17بأمان وفعالية. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن يحفز PDGF-BB تولد الأوعية بتحفيز الخلايا غشائي الهجرة والانتشار في فيفو18،19. وعلاوة على ذلك، PDGF-BB يمكن أن تجعل أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) قادرة على التفريق في خلايا بطانية20، وهذا يسلط الضوء على مواصلة الدور المحتمل ل MSCs في نيوفاسكولاريزيشن. ولذلك، الذي يحفز تشكيل حيثياته المفرج في السقالات مع PDGF-BB خطوة هامة لإصلاح الأنسجة التي نمت في السقالات في هندسة الأنسجة العظام.
شفاء عيب العظام هو عملية morphogenetic أنسجة حيوية تتطلب منسقة تكون العظم والأوعية في مواقف إصلاح21. هو نيوانجيوجينيسيس إلى السقالات هندسة الأنسجة مزروع شرطا مسبقاً أساسيا لتزويد الخلايا بالمغذيات والأكسجين للنمو والبقاء على قيد الحياة وإزالة النفايات الأيضية. يشيع استخدام أساليب التصوير، بما في ذلك الأشعة السينية الصغرى-حسبت التصوير المقطعي (ميكروكت) والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، والتصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) والليزر [كنفوكل] الفحص المجهري، يتم تطبيق بدلاً من الفحص النسيجي للحصول على الأوعية المعلومات22،23. ومع ذلك، هذه الأساليب عقبات مختلفة في تصور وقياس نيوفاسكولاتوري في 3D السقالات في هندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هو تقنية بيو-تصوير رواية نسبيا يحتوي على ميزة واضحة في نفس الوقت تصور الخلايا، المصفوفة خارج الخلية، والمحيطة بشبكات الأوعية الدموية في المجراة. أنها تمتلك قدرة تصوير ثلاثي الأبعاد الملازمة لاختراق الأنسجة العميقة ويسبب د منخفضة. أم في العقد الماضي، ومن ثم فقد اكتسب الكثير من الاهتمام في الدراسات الطبية24، بما في ذلك في علم الأعصاب، وعلم المناعة، وديناميات الخلايا الجذعية. ومع ذلك، يتم استخدامه بالكاد في أبحاث العظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
العظم نسيج vascularized عاليا بقدرة فريدة على استمرار الشفاء وإعادة تشكيلها طوال عمر على الفردية1. مستوى الأوعية الدموية مهم لإصلاح تكون العظم وعيب. الأوعية منخفضة يحد التطبيق السريري واسعة لهندسة الأنسجة العظام. بناء العظام هندسة الأنسجة عالية vascularized وفقا لنظرية بيوميميتيقا أصب?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة وكان يدعمها “البرنامج الطاووس شنتشن”، الصين (رقم 110811003586331)، برنامج البحوث الأساسية شنتشن (رقم JCYJ20150401150223631، رقم JCYJ20150401145529020، ورقم JCYJ20160331190714896)، قوانغدونغ العامة البحوث وبناء القدرات الخاصة البرنامج (رقم 2015A020212030)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81501893)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية الكبرى للصين (2013CB945503)، برنامج الابتكار سيت للباحثين الشباب ممتازة (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
