Vi præsenterer her, en protokol for at visualisere blodkar dannelse i vivo og i realtid i 3D stilladser af multiphoton mikroskopi. Angiogenese i genetisk modificerede stilladser blev studeret i en murine calvarial kritiske knogle defekt model. Flere nye blodkar blev opdaget i gruppen behandling end kontrol.
Genopbygningen af kritisk størrelse knogledefekter forbliver en alvorlig klinisk problem på grund af dårlig angiogenese inden for væv-manipuleret stilladser under reparation, som giver anledning til en manglende tilstrækkelig blodforsyning og forårsager nekrose af nyt væv. Hurtig vascularization er en afgørende forudsætning for nye væv overlevelse og integration med eksisterende værten væv. De novo generation af Vaskulaturen i stilladser er et af de vigtigste skridt i at gøre knogle regenerering mere effektivt, giver mulighed for reparation væv til at vokse ind i et stillads. For at tackle dette problem, er den genetiske modifikation af en biomateriale stillads anvendes til at fremskynde angiogenese og osteogenesis. Men, visualisere og spore i vivo blodkar dannelse i realtid og i tre-dimensionelle (3D) stilladser eller nyt knoglevæv er stadig en hindring for knogle vævsmanipulering. Multiphoton mikroskopi (MPM) er en roman bio-imaging modalitet, der kan erhverve volumetriske data fra biologiske strukturer i en høj opløsning og minimalt invasiv måde. Formålet med denne undersøgelse var at visualisere angiogenese med multiphoton mikroskopi i vivo i en genetisk modificerede 3D-PLGA/nHAp stillads til calvarial kritiske knogle defekt reparation. PLGA/nHAp stilladser blev functionalized for vedvarende levering af en vækstfaktor pdgf-b genet bærer lentiviral vektorer (LV –pdgfb) for at lette angiogenese og forbedre knogle regenerering. I et stillads-implanteret calvarial kritiske knogle defekt musemodel, blodkar områder (BVAs) i PHp stilladser var betydeligt højere end i PH stilladser. Derudover steg udtryk af pdgf-b og angiogenese-relaterede gener, vWF og VEGFR2, tilsvarende. MicroCT analyse viste, at den nye knogledannelse i gruppen PHp dramatisk forbedret sammenlignet med de andre grupper. Til vores viden er det første gang multiphoton mikroskopi blev brugt i knoglen vævsmanipulering for at undersøge angiogenese i en 3D bio-nedbrydelige stillads i vivo og i realtid.
Bone er en yderst vaskulariserede væv, der fortsætter med at remodel i løbet af en enkelt1. Hurtig og effektiv knogle regenerering af store knogledefekter som følge af traumer, ophelet, tumor resektion eller kraniofaciale misdannelser er et komplekst fysiologisk proces. Traditionelle terapeutiske metoder anvendes til knogle defekt reparation omfatter autograft og allograft implantation, men deres anvendelse indebærer flere problemer og begrænsninger, såsom begrænset tilgængelighed, væsentlig donor site sygelighed, en høj risiko for infektion, og vært immun afvisning2,3. Men kunstig knogle vin tilbyder et effektivt alternativ til at afhjælpe disse begrænsninger. De kan være fremstillet af bionedbrydelige materialer, er let at fremstille med en egnet porestørrelse og kan være genetisk modificerede4,5.
I øjeblikket har forskellige tissue engineering stilladser været ansat i udviklingen af væv-manipuleret knogle6,7. For at fremkalde knogle reparation og regeneration mere effektivt, har manipuleret biomaterialer kombineret med vækstfaktorer opstået og opnåede gode resultater8,9. Desværre begrænse kort halveringstid, let at miste aktivitet og suprafysiologiske dosering af vækstfaktorer for terapeutisk virkning deres kliniske anvendelse10. For at overvinde disse problemer, har levering af vækstfaktor gener i stedet for vækstfaktorer vist sig som en effektiv metode til at fastholde bioactivity til behandling af ossøse defekter og sygdomme11,12. Virale vektorer er lovende levering værktøjer til vævsregeneration på grund af deres høje udtrykker effektivitet13.
Blandt vækstfaktorer, blev Trombocyt-afledt vækst faktor (PDGF-BB) valgt i denne undersøgelse, fordi det er ikke kun en mitogen og chemoattractant for mesenchymale og osteogenic celler, men også en stimulans for angiogenese14,15 . Tidligere prækliniske og kliniske undersøgelser viste, at PDGF BB kunne sikkert og effektivt fremme bone reparation i parodontale ossøse defekter16,17. Nylige undersøgelser afslørede, at PDGF BB stimulerer angiogenese af motiverende endotel celle migration og spredning i vivo18,19. Derudover kan PDGF BB også gengive mesenchymale stamceller (msc) i stand til at differentiere i endothelial celler20, og denne yderligere højdepunkter MSCs potentielle rolle i neovascularization. Inducerende de novo dannelsen af Vaskulaturen i stilladser med PDGF BB er derfor et vigtigt skridt for reparation af væv vokset til stilladser i knoglen vævsmanipulering.
Defekt knogleheling er en dynamisk væv morfogenetiske proces, som kræver koordineret osteogenesis og angiogenese på reparation positioner21. Neoangiogenesis i implanterede væv-manipuleret stilladser er en afgørende forudsætning for at levere celler med næringsstoffer og ilt til vækst og overlevelse og til fjernelse af metaboliske affald. Almindeligt anvendt imaging metoder, beregnet herunder X-ray mikro-tomografi (microCT), magnetisk resonans imaging (MR), scanning elektronmikroskopi (SEM), optisk kohærens tomografi (OCT) og konfokal laser scanning mikroskopi, anvendes i stedet for Histologisk undersøgelse at opnå angiogenese oplysninger22,23. Disse metoder står imidlertid over forskellige forhindringer i visualisering og måling af neovasculature i 3D stilladser i knoglen vævsmanipulering. Multiphoton mikroskopi (MPM) er en forholdsvis ny bio-imaging teknik, der har særskilte fordelen ved samtidig visualisere celler, ekstracellulære matrix, og de omkringliggende vaskulære netværk in vivo. Det har en iboende tredimensional billeddannelse evne til dybe væv penetration og forårsager lav solskader. Derfor, i det sidste årti, MPM har fået meget opmærksomhed i biomedicinsk undersøgelser24, herunder i neurovidenskab, immunologi og stamceller dynamik. Dog er det næppe anvendes i ortopædiske forskning.
Bone er en yderst vaskulariserede væv med en enestående kapacitet til løbende at helbrede og remodel i hele levetiden for en individuel1. Vascularization er vigtigt for osteogenesis og defekt reparation. Lav vascularization begrænser bred klinisk anvendelse af væv-manipuleret knogle. Konstruere en yderst vaskulariserede væv-manipuleret knogle ifølge teorien om Biomimetik er blevet et værktøj til at reparere store segment knogledefekter. Forskellige former for stilladser har været anvendt…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Shenzhen Peacock Program, Kina (nr. 110811003586331), Shenzhen grundlæggende Research Program (nr. JCYJ20150401150223631, nr. JCYJ20150401145529020 og nr. JCYJ20160331190714896), Guangdong offentlig forskning og kapacitetsopbygning særlige programmet (nr. 2015A020212030), National Natural Science Foundation i Kina (nr. 81501893), den nationale Major Basic Research Program af Kina (2013CB945503), og den SIAT Innovation Program til fremragende yngre forskere (Y5G010).
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
Transwell | Corning | 3422 | |
Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
Paraffin | Leica | RM2235 | |
Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
microCT | Bruker | 1176 | |
commercial software | Bruker |