Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.
Abstract
Die Rekonstruktion der kritisch große Knochendefekte bleibt ein ernstes klinische Problem wegen schlechten Angiogenese im Tissue-Engineering Gerüste während der Reparatur, die führt zu einem Mangel an ausreichender Blutversorgung und Nekrose des neuen Gewebes verursacht. Rasche Vaskularisierung ist eine wesentliche Voraussetzung für das neue Gewebe überleben und Integration mit bestehenden Wirtsgewebe. Die de-Novo -Generation des Gefäßsystems in Gerüste ist einer der wichtigsten Schritte bei der Herstellung Knochenregeneration effizienter, so dass Reparatur Gewebe in ein Gerüst zu wachsen. Um dieses Problem zu lösen, wird die gentechnische Veränderung von einem Biomaterial Gerüst zur Angiogenese und Osteogenesis beschleunigen. Allerdings ist Visualisierung und tracking in Vivo Blutgefäß-Bildung in Echtzeit und im dreidimensionalen (3D) Gerüste oder neues Knochengewebe noch ein Hindernis für das Bone Tissue Engineering. Multiphoton Mikroskopie (MPM) ist eine neuartige Bio-Imaging-Modalität, die volumetrische Daten aus biologischer Strukturen in hoher Auflösung und minimal-invasive Weise erwerben kann. Ziel dieser Studie war es, Angiogenese mit multiphoton Mikroskopie in Vivo in einer gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für die calvarial kritische Knochen defekt Reparatur zu visualisieren. PLGA/nHAp Gerüste wurden für die nachhaltige Lieferung eines Wachstumsfaktors Pdgf-b Gens tragen Lentivirale Vektoren (LV –Pdgfb) Angiogenese zur Erleichterung und Verbesserung der Knochenregeneration funktionalisiert. In einem Gerüst-implantierten calvarial kritische Knochen defekte Maus-Modell, die Blutgefäß-Bereiche (BVAs) in PHp Gerüste waren deutlich höher als bei PH-Gerüste. Darüber hinaus erhöht sich der Ausdruck von Pdgf-b und Angiogenese-Genen, vWF und VEGFR2, entsprechend. MicroCT-Analyse ergab, dass die Knochenneubildung in der PHp Group erheblich verbessert im Vergleich zu den anderen Gruppen. Unseres Wissens ist dies das erste Mal multiphoton Mikroskopie im Knochen Gewebe-Engineering verwendet wurde, um die Angiogenese in einem 3D biologisch abbaubaren Gerüst in Vivo und in Echtzeit zu untersuchen.
Introduction
Knochen ist ein stark vaskularisierte Gewebe, die auch weiterhin während der Laufzeit eines einzelnen1umzugestalten. Die schnelle und effektive Knochenregeneration von großen Knochendefekten infolge Trauma, Pseudarthrose, Tumor Resektionen oder kraniofaziale Fehlbildungen ist ein komplexer physiologischer Vorgang. Traditionelle therapeutische Ansätze verwendet für Knochen defekt Reparatur Autotransplantation und Allograft-Implantierung unter anderem ihre Verwendung umfasst mehrere Probleme und Einschränkungen, z. B. begrenzte Verfügbarkeit, wichtiger Geber Website Morbidität, ein hohes Risiko der Infektion, und Hosten Sie Immunabwehr2,3. Künstliche Knochentransplantate bieten jedoch eine effiziente Alternative um diese Einschränkungen zu lindern. Sie können aus biologisch abbaubaren Materialien hergestellt werden, sind einfach zu fabrizieren werden mit einer geeigneten Porengröße und können genetisch veränderten4,5.
Verschiedene Gewebe-engineering-Gerüste sind derzeit in der Entwicklung von Tissue-Engineering Knochen6,7eingesetzt worden. Knochen-Reparatur und Regeneration effektiver induzieren, veränderte Biomaterialien kombiniert mit Wachstumsfaktoren entstanden und erzielt gute Ergebnisse8,9. Leider begrenzen die kurze Halbwertszeit, leicht zu verlieren-Aktivität und Supraphysiological Dosierung von Wachstumsfaktoren für die therapeutische Wirksamkeit ihrer klinischen Anwendung10. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die Lieferung von Wachstumsfaktor Genen anstelle von Wachstumsfaktoren als einen wirksamen Ansatz zu Bioaktivität zur Behandlung von knöcherner Defekte und Krankheiten11,12nachgewiesen. Virale Vektoren sind vielversprechende Lieferung Werkzeuge für die Geweberegeneration aufgrund ihrer hohen Effizienz13zum Ausdruck zu bringen.
Unter den Wachstumsfaktoren wurde Platelet-derived Wachstumsfaktor (PDGF-BB) in dieser Studie ausgewählt, weil es nicht nur ein Mitogen und Lockstoffgradient für mesenchymale und osteogene Zellen, sondern auch ein Stimulans für Angiogenese14,15 ist . Präklinische und klinische Studien zeigten, dass PDGF-BB Knochen Reparatur parodontalen knöcherner Defekte16,17sicher und effektiv fördern könnte. Neuere Studien gezeigt, dass PDGF-BB Angiogenese durch motivierende Endothelzellen Migration und Proliferation in Vivo18,19stimuliert. Außerdem kann PDGF-BB auch mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in der Lage, Differenzierung in Endothelzellen20, und diese weitere Highlights die potenzielle Rolle von MSCs in Neovaskularisation machen. Induzieren die de Novo Bildung des Gefäßsystems in Gerüste mit PDGF-BB ist daher ein wichtiger Schritt für die Reparatur von Gewebe zu Gerüste in Knochen Gewebe-Engineering entwickelt.
Knochenheilung defekt ist ein dynamisches Gewebe morphogenetischen Prozess, der koordinierte Osteogenesis und Angiogenese bei der Reparatur von Positionen21erfordert. Neoangiogenese in implantierten Tissue-Engineering Gerüste ist eine wesentliche Voraussetzung für die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff für Wachstum und überleben und zum Entfernen von Stoffwechselschlacken. Häufig verwendet, bildgebende Verfahren, berechnete Mikro-einschließlich Röntgen Computertomographie (MicroCT), Magnet-Resonanz-Tomographie (MRI), Rasterelektronenmikroskopie (SEM), Optische Kohärenztomografie (OCT) und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, anstelle von angewendet werden histologische Untersuchung Angiogenese Informationen22,23zu erhalten. Diese Methoden stehen jedoch verschiedene Hindernisse zu visualisieren und Neovasculature in 3D Gerüste im Knochen Tissue Engineering zu messen. Multiphoton Mikroskopie (MPM) ist eine vergleichsweise neue Bio-Imaging-Technik, die den entscheidenden Vorteil gleichzeitig Zellen, extrazelluläre Matrix, die Visualisierung und die umliegenden vaskulärer Netzwerken hat in-vivo. Es besitzt eine inhärente dreidimensionale Bildgebung Fähigkeit für tiefe Gewebe eindringen und verursacht geringe lichtbedingten. Daher hat MPM in den letzten zehn Jahren viel Aufmerksamkeit in biomedizinischen Studien24, darunter in Neurowissenschaften, Immunologie und Stammzellen Dynamik gewonnen. Es ist jedoch kaum in der orthopädischen Forschung verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Knochen ist ein stark vaskularisierte Gewebe mit einer einzigartigen Kapazität kontinuierlich zu heilen und während der gesamten Lebensdauer eines einzelnen1umzugestalten. Das Niveau der Vaskularisierung ist wichtig für Osteogenesis und defekt Reparatur. Niedrige Vaskularisierung begrenzt die breite klinische Anwendung von Tissue-Engineering Knochen. Bau eines stark vaskularisierte Tissue-Engineering Knochens nach der Theorie der Bionik ist ein Werkzeug für die Reparatur von Knochendefekten gr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch das Shenzhen Pfau Programm, China (Nr. 110811003586331), Shenzhen Basic Research-Programm (No. JCYJ20150401150223631, Nr. JCYJ20150401145529020 und Nr. JCYJ20160331190714896), Guangdong öffentliche Forschung und Kapazitätsaufbau Sonderprogramm (Nr. 2015A020212030), National Natural Science Foundation of China (Nr. 81501893), das National Major Basic Forschungsprogramm von China (2013CB945503), und die SIAT Innovationsprogramm für exzellente junge Forscher (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
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