Angiogenesis visualizing द्वारा Multiphoton माइक्रोस्कोपी में आनुवंशिक रूप से संशोधित 3 डी-PLGA/Calvarial क्रिटिकल हड्डी दोष मरंमत के लिए nHAp पाड़
Summary
यहाँ, हम vivo में रक्त वाहिका गठन कल्पना और 3 डी पाड़ों में वास्तविक समय में multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । आनुवंशिक रूप से संशोधित पाड़ों में Angiogenesis एक murine calvarial क्रिटिकल बोन दोष मॉडल में अध्ययन किया गया था । अधिक नई रक्त वाहिकाओं नियंत्रण में से उपचार के समूह में पाया गया ।
Abstract
गंभीर रूप से आकार के अस्थि दोषों के पुनर्निर्माण एक गंभीर नैदानिक समस्या है क्योंकि ऊतक के भीतर गरीब angiogenesis की मरंमत के दौरान इंजीनियर पाड़, जो पर्याप्त रक्त की आपूर्ति की कमी को जंम देता है और नए ऊतकों के परिगलन का कारण बनता है । रैपिड vascularization नए ऊतक अस्तित्व और मौजूदा मेजबान ऊतक के साथ एकीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है । पाड़ों में vasculature के de नोवो पीढ़ी हड्डी पुनर्जनन अधिक कुशल बनाने में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, की मरंमत ऊतक एक पाड़ में विकसित करने की अनुमति । इस समस्या से निपटने के लिए, एक भौतिक पाड़ के आनुवंशिक संशोधन angiogenesis और आस्टियोजेनेसिस में तेजी लाने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, visualizing और वास्तविक समय में और तीन आयामी (3 डी) पाड़ या नए अस्थि ऊतक में vivo रक्त वाहिका गठन में ट्रैकिंग अभी भी हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक बाधा है । Multiphoton माइक्रोस्कोपी (MPM) एक उपंयास जैव इमेजिंग रूपरेखा है कि एक उच्च संकल्प और ंयूनतम इनवेसिव तरीके से जैविक संरचनाओं से volumetric डेटा प्राप्त कर सकते हैं । इस अध्ययन का उद्देश्य calvarial क्रिटिकल बोन दोष की मरंमत के लिए एक आनुवंशिक रूप से संशोधित 3 डी-PLGA/nHAp पाड़ में vivo में multiphoton माइक्रोस्कोपी के साथ angiogenesis कल्पना थी । PLGA/nHAp पाड़ों एक विकास कारक के निरंतर वितरण के लिए कार्यात्मक थे pdgf-बी जीन ले lentiviral वैक्टर (LV-pdgfb) क्रम में angiogenesis की सुविधा के लिए और हड्डी पुनर्जनन बढ़ाने के लिए । एक पाड़ प्रत्यारोपित calvarial क्रिटिकल बोन दोष माउस मॉडल में, रक्त वाहिका क्षेत्रों (BVAs) PHp पाड़ों में काफी पीएच पाड़ों की तुलना में अधिक थे । इसके अतिरिक्त, pdgf-बी और angiogenesis से संबंधित जीन, vWF और VEGFR2की अभिव्यक्ति, तदनुसार वृद्धि हुई । MicroCT विश्लेषण संकेत दिया है कि नए PHp समूह में हड्डी गठन नाटकीय रूप से अंय समूहों की तुलना में सुधार हुआ । हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली बार है multiphoton माइक्रोस्कोपी में प्रयोग किया जाता था अस्थि ऊतक-इंजीनियरिंग में angiogenesis की जांच करने के लिए एक 3d बायो-सड़ पाड़ vivo में और वास्तविक समय में.
Introduction
हड्डी एक उच्च संवहनी ऊतक है कि एक व्यक्ति के जीवनकाल के दौरान फिर से बनाना जारी है1। आघात, संघ, ट्यूमर लकीरें, या craniofacial विकृतियों से उत्पंन बड़ी हड्डी दोष के तेजी से और प्रभावी अस्थि पुनर्जनन एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है । अस्थि दोष की मरंमत के लिए इस्तेमाल किया पारंपरिक चिकित्सीय दृष्टिकोण शामिल है भ्रष्टाचार और allograft आरोपण, लेकिन उनके उपयोग में कई समस्याओं और सीमित उपलब्धता, महत्वपूर्ण दाता साइट रुग्णता, संक्रमण के एक उच्च जोखिम के रूप में सीमाएं, शामिल है, और मेजबान प्रतिरक्षा अस्वीकृति2,3। हालांकि, कृत्रिम अस्थि भ्रष्टाचार इन सीमाओं को कम करने के लिए एक कुशल विकल्प प्रदान करते हैं । वे biodegradable सामग्री से बनाया जा सकता है, आसान कर रहे है एक उपयुक्त ताकना आकार के साथ गढ़े हो, और आनुवंशिक रूप से4,5संशोधित किया जा सकता है ।
वर्तमान में, विभिंन ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ों ऊतक के विकास में नियोजित किया गया है इंजीनियर हड्डी6,7। हड्डी की मरंमत और पुनर्जनन अधिक प्रभावी ढंग से प्रेरित करने के लिए, इंजीनियर विकास कारकों के साथ संयुक्त सामग्री उभरा है और अच्छे परिणाम प्राप्त8,9। दुर्भाग्य से, कम आधा जीवन, आसान करने के लिए खो गतिविधि, और चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए विकास कारकों की supraphysiological खुराक उनके नैदानिक आवेदन10सीमा. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, विकास कारकों के बजाय वृद्धि कारक जीन के वितरण के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में प्रदर्शन किया गया है osseous दोषों और रोगों11,12के उपचार के लिए प्रतिपूर्ति के लिए प्रतिक्रिया को बनाए रखने । वायरल वैक्टर ऊतक पुनर्जनन उनके उच्च एक्सप्रेस दक्षता13के कारण के लिए वितरण उपकरण का वादा कर रहे हैं ।
वृद्धि कारकों के अलावा, प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF-BB) इस अध्ययन में चुना गया था क्योंकि यह न केवल mesenchymal और osteogenic कोशिकाओं के लिए एक mitogen और chemoattractant है, लेकिन यह भी angiogenesis के लिए एक उत्तेजक14,15 . पिछले पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि PDGF-BB सुरक्षित रूप से और प्रभावी ढंग से periodontal osseous दोषों16,17में हड्डी की मरंमत को बढ़ावा देने सकता है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि PDGF-BB vivo18,19 मेंendothelial सेल माइग्रेशन और जखीरे को प्रेरित करके angiogenesis को उत्तेजित करता है । इसके अलावा, PDGF-BB भी mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को रेंडर कर सकते हैं (MSCs) endothelial कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम20, और यह आगे MSCs में neovascularization की संभावित भूमिका पर प्रकाश डाला गया. इसलिए, PDGF-BB के साथ पाड़ों में vasculature के de नोवो गठन उत्प्रेरण हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग में पाड़ में बड़े ऊतक की मरंमत के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।
अस्थि दोष हीलिंग एक गतिशील ऊतक morphogenetic प्रक्रिया है कि समंवित आस्टियोजेनेसिस और angiogenesis की मरंमत के पदों पर21की आवश्यकता है । प्रत्यारोपित ऊतक में Neoangiogenesis-इंजीनियर पाड़ एक आवश्यक पूर्व पोषक तत्वों और विकास और अस्तित्व के लिए ऑक्सीजन और चयापचय अपशिष्ट को हटाने के लिए के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति के लिए अपेक्षित है । आमतौर पर इस्तेमाल किया इमेजिंग तरीकों, सहित एक्स-रे माइक्रो गणना टोमोग्राफी (microCT), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT), और फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी, के बजाय लागू कर रहे हैं ऊतकीय परीक्षा angiogenesis सूचना प्राप्त गर्न२२,२३। हालांकि, इन तरीकों visualizing और अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग में 3 डी पाड़ में neovasculature को मापने में विभिंन बाधाओं का सामना । Multiphoton माइक्रोस्कोपी (MPM) एक तुलनात्मक उपंयास जैव इमेजिंग तकनीक है कि एक साथ के विशिष्ट लाभ है कोशिकाओं visualizing, extracellular मैट्रिक्स, और vivo में संवहनी नेटवर्क के आसपास । यह गहरी ऊतक प्रवेश के लिए एक अंतर्निहित तीन आयामी इमेजिंग क्षमता के पास और कम धूप का कारण बनता है । इसलिए, पिछले दशक में, MPM जैव चिकित्सा अध्ययन में अधिक ध्यान दिया है24, तंत्रिका विज्ञान, इम्यूनोलॉजी में सहित, और स्टेम सेल गतिशीलता । हालांकि, यह बमुश्किल आर्थोपेडिक अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है ।
Protocol
पशु देखभाल गुआंग्डोंग प्रांत के प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका के साथ अनुपालन में था । सभी प्रक्रियाओं पशु अनुसंधान, शेन्ज़ेन उंनत प्रौद्योगिकी, चीनी अकादमी विज्ञान के सं?…
Representative Results
Discussion
हड्डी एक अद्वितीय क्षमता के साथ एक उच्च संवहनी ऊतक है लगातार चंगा करने के लिए और एक व्यक्ति के जीवनकाल भर में remodel1। आस्टियोजेनेसिस और दोष मरम्मत के लिए vascularization का स्तर महत्वपूर्ण है । कम vascularization ऊतक…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के शेन्ज़ेन मोर कार्यक्रम, चीन (सं. ११०८११००३५८६३३१), शेन्ज़ेन बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (सं. JCYJ20150401150223631, सं. JCYJ20150401145529020, और सं. JCYJ20160331190714896), गुआंग्डोंग सार्वजनिक अनुसंधान और क्षमता निर्माण विशेष कार्यक्रम (सं. 2015A020212030), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. ८१५०१८९३), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2013CB945503), और सियाट नवाचार कार्यक्रम के लिए उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं (Y5G010) ।
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
