Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare formazione del vaso sanguigno in vivo e in tempo reale in 3D impalcature da microscopia multifotonica. Angiogenesi in impalcature geneticamente è stato studiato in un modello di difetto critico calvarial murino dell’osso. Più nuovi vasi sanguigni sono stati rilevati nel gruppo di trattamento rispetto ai controlli.
Abstract
La ricostruzione di difetti ossei criticamente dimensioni rimane un grave problema clinico a causa della scarsa angiogenesi all’interno di impalcature tessutale durante la riparazione, che dà luogo a una mancanza di sufficiente apporto di sangue e causa la necrosi dei tessuti nuovi. Rapida vascolarizzazione è un prerequisito indispensabile per la sopravvivenza del tessuto nuovo e integrazione con esistente tessuto ospite. La generazione del de novo del sistema vascolare in impalcature è uno dei passi più importanti nel rendere più efficiente, permettendo la riparazione del tessuto di crescere in un’impalcatura rigenerazione ossea. Per affrontare questo problema, la modificazione genetica di un ponteggio di biomateriale viene utilizzata per accelerare l’angiogenesi e l’osteogenesi. Tuttavia, visualizzazione e monitoraggio in vivo la formazione del vaso sanguigno in tempo reale e in impalcature tridimensionali (3D) in o nuovo tessuto osseo è ancora un ostacolo per l’ingegneria tissutale ossea. La microscopia multifotonica (MPM) è una modalità novella di bio-imaging che può acquisire dati volumetrici da strutture biologiche in modo minimamente invasivo e ad alta risoluzione. L’obiettivo di questo studio era di visualizzare l’angiogenesi con microscopia multifotonica in vivo in un’impalcatura di 3D-PLGA/nHAp geneticamente modificata per la riparazione del difetto di osso calvarial critico. PLGA/nHAp ponteggi sono stati funzionalizzati per la consegna continua di un gene di pdgf-b di fattore di crescita che trasportano vettori lentivirali (LV –pdgfb) al fine di facilitare l’angiogenesi e migliorare la rigenerazione ossea. In un osso di critico calvarial impalcatura-impiantati difetto modello murino, le aree di vaso sanguigno (BVAs) in PHp impalcature erano significativamente superiori a PH impalcature. Inoltre, l’espressione di geni in relazione con l’angiogenesi, sindrome di Raynaud e VEGFR2e pdgf-b aumentato corrispondentemente. MicroCT analisi ha indicato che la nuova formazione dell’osso nel gruppo PHp notevolmente migliorato rispetto agli altri gruppi. A nostra conoscenza, questa è la prima volta microscopia multifotonica era usata in ingegneria dei tessuti dell’osso per studiare l’angiogenesi in un 3D impalcatura bio-degradabile, in vivo e in tempo reale.
Introduction
L’osso è un tessuto altamente vascularized che continua a rimodellare durante la vita di un singolo1. La rigenerazione ossea rapida ed efficace di difetti ossei grande derivanti dal trauma, non sindacale, resezioni del tumore o malformazioni craniofacciali è un processo fisiologico complesso. Tradizionali approcci terapeutici utilizzati per la riparazione di difetti dell’osso includono l’impianto autologo e allogenico, ma il loro uso comporta diversi problemi e limitazioni, quali disponibilità limitata, morbilità del sito donatore significativo, un alto rischio di infezione, e ospitare il rigetto immunitario2,3. Tuttavia, gli innesti di osso artificiale offrono un’alternativa efficiente per ovviare a queste limitazioni. Può essere realizzate in materiali biodegradabili, sono facili a essere fabbricare con un diametro dei pori adatto e può essere geneticamente4,5.
Attualmente, vari ponteggi ingegneria del tessuto sono stati impiegati nello sviluppo di ingegneria tissutale ossea6,7. Per indurre la rigenerazione e riparazione ossea in modo più efficace, biomateriali ingegnerizzati combinati con fattori di crescita sono emerse e raggiunto buoni risultati8,9. Purtroppo, il tempo di dimezzamento breve, facile perdere attività e supraphysiological dosaggio di fattori di crescita per l’efficacia terapeutica limitare loro applicazione clinica10. Per superare questi problemi, la consegna dei geni del fattore di crescita invece di fattori di crescita è stata dimostrata come un approccio efficace per sostenere la bioattività per il trattamento dei difetti ossei e malattie11,12. Vettori virali sono promettente consegna strumenti per la rigenerazione dei tessuti a causa della loro alta efficienza13di esprimere.
Tra i fattori di crescita, fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-BB) è stato selezionato in questo studio perché è non solo un mitogeno e fattore chemiotattico per le cellule mesenchimali e osteogeniche, ma anche uno stimolante per l’angiogenesi14,15 . Precedenti studi preclinici e clinici hanno mostrato che PDGF-BB potrebbe promuovere in modo sicuro ed efficace riparazione ossea in difetti osseous peridentali16,17. Studi recenti hanno rivelato che PDGF-BB stimola l’angiogenesi di motivante delle cellule endoteliali migrazione e proliferazione in vivo18,19. Inoltre, PDGF-BB può anche rendere cellule staminali mesenchimali (MSCs) in grado di differenziarsi in cellule endoteliali20e questo ulteriore mette in evidenza il ruolo potenziale delle MSC in neovascolarizzazione. Di conseguenza, inducendo la formazione del de novo del sistema vascolare in impalcature con PDGF-BB è un passo importante per la riparazione del tessuto coltivato in impalcature in ingegneria del tessuto osseo.
La guarigione del difetto osseo è un processo morfogenetico tessuto dinamico che richiede osteogenesi coordinata e l’angiogenesi del riparazione posizioni21. La neoangiogenesi in impalcature tessutale impiantate è un prerequisito essenziale per la fornitura di cellule con sostanze nutritive e ossigeno per la crescita e la sopravvivenza e per la rimozione delle scorie metaboliche. Comunemente utilizzati metodi di imaging, tra cui x-ray micro-computato tomografia (microCT), la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), microscopia elettronica a scansione (SEM), tomografia a coerenza ottica (OCT) e laser confocale microscopia, sono applicati invece esame istologico per ottenere l’angiogenesi informazioni22,23. Tuttavia, questi metodi devono affrontare vari ostacoli nella visualizzazione e nella misurazione neovasculature in 3D impalcature in ingegneria del tessuto osseo. La microscopia multifotonica (MPM) è una tecnica di bio-imaging comparativamente Novella che ha il vantaggio di contemporaneamente visualizzare cellule, matrice extracellulare e che circondano reti vascolari in vivo. Possiede un’intrinseca capacità di imaging tridimensionale per la penetrazione dei tessuti profondi e causa basso photodamage. Quindi, nell’ultimo decennio, MPM ha guadagnato molta attenzione in studi biomedici24, compresi in neuroscienze, immunologia e dinamiche della cellula formativa. Tuttavia, è a malapena usato nella ricerca ortopedica.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’osso è un tessuto altamente vascularized con una singolare capacità di guarire e rimodellare tutta la durata di un singolo1continuamente. Il livello di vascolarizzazione è importante per la riparazione di osteogenesi e difetto. Bassa vascolarizzazione limita l’applicazione clinica larga dell’osso tessutale. Costruire un osso altamente vascularized tessutale secondo la teoria di biomimetica è diventato uno strumento per la riparazione di difetti ossei grande segmento. Vari tipi di ponteggi so…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal programma di pavone di Shenzhen, Cina (No. 110811003586331), il programma di ricerca base di Shenzhen (No. JCYJ20150401150223631, no. JCYJ20150401145529020 e no. JCYJ20160331190714896), il Guangdong ricerca e sviluppo di capacità speciale programma pubblico (n. 2015A020212030), la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (No. 81501893), il programma di ricerca di base maggiore nazionale della Cina (2013CB945503) e la Programma di innovazione SIAT per eccellenti giovani ricercatori (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
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