頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化
Summary
ここでは、血管形成生体内可視化するプロトコルを提案と多光子顕微鏡による 3 D 足場でリアルタイム。重要な性マウス頭蓋骨骨欠損モデルにおける血管新生遺伝子組み換え足場を調べた。コントロールの治療群よりもより新しい血管を認めた.
Abstract
批判的に大きさで分類された骨欠損の再建では、組織設計の足場内悪い血管新生のための十分な血液供給不足を生じ、新しい組織の壊死を引き起こす修復中に深刻な臨床問題が残ります。急激な血管新生は、新しい組織の生存と既存のホスト組織との統合のための重要な前提条件です。足場でのデノボ生成は、骨再生の足場に成長する組織を修復できるように効率の最も重要な手順の 1 つです。この問題に取り組むため、骨形成と血管新生を促進する生体材料足場の遺伝子組み換えを使用します。可視化して体内の追跡血管形成をリアルタイムかつ 3次元 (3 D) 足場または新しい骨のティッシュでは、まだ骨の組織工学のための障害。多光子顕微鏡 (MPM) は、高解像度かつ低侵襲に生物学的構造から体積データを集録することができます新しいバイオ イメージング モダリティです。本研究の目的は、多光子顕微鏡による生体内で頭蓋骨の重要な骨欠損修復用遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場内血管新生を視覚化するだった。PLGA/nHAp 足場は血管新生を促進するために、骨の再生を強化するレンチウイルスベクター (LV-pdgfb) を運ぶ成長因子pdgf b遺伝子の持続的な配達のため修飾されました。足場を注入した頭蓋骨重要な骨の欠損マウス モデル、PHp 足場で血管領域 (変更できます |) PH 足場よりも有意に高かった。また、 pdgf bとvWFとVEGFR2、血管新生関連遺伝子の発現はそれに応じて増加しました。:Microct 分析は、飛躍的に PHp グループの新生骨の形成が他のグループに比べると示されました。私たちの知る限りこれは多光子顕微鏡は生体内で3 D の生物分解性の足場とリアルタイムでは血管新生を調べる骨の組織工学で使用されたの初めて。
Introduction
骨は、個々 の1の有効期間中に改造を続けている高度に血管組織です。大きな骨欠損偽関節、外傷、腫瘍切除、または顔面の奇形に起因の迅速かつ効果的な骨再生は、複雑な生理学的なプロセスです。骨欠損修復のため従来の治療アプローチは、自家および同種移植が彼らの使用を含むいくつかの問題や制限などの限られた可用性、大幅にドナー サイト罹患率、感染症のリスクが高いと免疫拒絶2,3をホストします。ただし、人工骨移植は、これらの制限を軽減するために効率的な代替手段を提供しています。彼らは生分解性材料から作ることが、簡単に適した細孔サイズを作製して、遺伝子組み換え4,5をすることができます。
現在、様々 なティッシュ工学足場は組織設計の骨6、7の開発に採用されています。骨の修復と再生をより効率的に誘導するために設計された生体成長因子の併用は登場して良い結果8,9を達成しました。残念なことに、半減期が短い、簡単に失うアクティビティ、および治療の成長因子の生理学的用量の限界、臨床応用10。これらの問題を克服するために代わりに、成長因子の成長因子遺伝子の配信は骨欠損と疾患11,12の治療のための生物活性を維持するために効果的な方法として実証されています。ウイルスのベクトルが有望な配信、高効率13を表現による組織再生のためのツール。
成長要因のうち、マイトジェンと間葉系と骨の細胞走化性因子のみならず、血管新生14,15覚醒剤だからは、本研究で血小板由来成長因子 (PDGF BB) の選ばれました。.前臨床および臨床研究は示したこと PDGF-BB が安全かつ効果的に修復を促す骨、歯周骨欠損16,17。最近の研究では、やる気にさせる内皮細胞の移行および拡散体内18,19PDGF-BB が血管新生を刺激することを明らかにしました。さらに、PDGF BB もレンダリングできます間葉系幹細胞 (MSCs) 内皮細胞20、およびこのさらにハイライトに血管新生における MSCs の潜在的な役割を分化。したがって、骨再生の足場に成長して組織の修復のための重要なステップは、PDGF-BB の足場で血管のde novoの形成を誘導します。
骨欠損の治癒は、調整された骨形成と修復位置21で血管新生が必要な動的組織形成プロセスです。注入の組織設計の足場に促進、細胞栄養素と老廃物を除去するための成長と生存に酸素を供給するための不可欠な前提です。イメージング法を用い、x 線を含むマイクロ計算 ct により、磁気共鳴画像 (MRI)、走査型電子顕微鏡 (SEM)、光干渉断層計 (OCT)、共焦点レーザ走査型顕微鏡の代わりに適用されます。血管新生情報22,23を取得する病理。ただし、これらのメソッドの可視化と骨再生組織工学における足場を 3 D で新生微小の測定の様々 な障害に直面します。多光子顕微鏡 (MPM) は同時に細胞、細胞外マトリックスを可視化し、周囲の血管ネットワークの明確な利点を持っている比較的新しいバイオ イメージング技術体内。それは深部組織浸透のため固有三次元イメージング機能を所有している、低光損傷を引き起こします。したがって、過去 10 年間、MPM は、バイオメディカル研究24、神経科学、免疫学、幹細胞ダイナミクスを含む多くの注意を得ています。しかし、それはやっと整形外科研究であります。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨は、継続的に癒すために、個々 の1の有効期間を通じて改造するユニークな能力を持つ高度に血管組織です。血管新生のレベルは骨形成や欠陥修理のため重要です。低血管新生骨のティッシュ エンジニア リングの幅広い臨床応用が制限されます。バイオミメティクスの理論によると高度に血管組織エンジニア リングの骨を構築する大きなセグメント骨欠損を修復するた?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、深セン孔雀プログラム、中国 (第 110811003586331)、深圳の基本的な研究プログラム (号によって支えられました。JCYJ20150401150223631 号JCYJ20150401145529020、そして号JCYJ20160331190714896)、広東省公共研究と能力開発特別プログラム (第 2015A020212030)、(81501893 号) 中国の国家自然科学基金、中国 (2013CB945503) の国立大基礎研究プログラムと優れた若手研究者 (Y5G010) ため SIAT 革新プログラムです。
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
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