Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

Summary

여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

Abstract

비판적으로 크기의 뼈 결함의 재건 복구, 충분 한 혈액 공급의 부족 하 고 새로운 조직의 괴 사를 일으키는 동안 가난한 신생 조직 엔지니어링 건설 기계 내에서 인해 심각한 임상 문제 남아 있다. 신속한 vascularization 새로운 조직의 생존 및 기존 호스트 조직 통합에 대 한 중요 한 전제 조건입니다. 맥 관 구조 건설 기계에서의 드 노 보 세대 뼈 재생 좀 더 효율적인, 수 있도록 복구를 발판으로 성장 하는 조직에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 문제를 해결 하려면 소재 비 계의 유전 수정 골 신생을 촉진 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 시각화 및 추적 vivo에서 실시간으로 3 차원 (3D) 건설 기계 또는 새로운 뼈 조직에 혈관 형성은 여전히 뼈 조직 공학에 대 한 장애물. Multiphoton 현미경 (MPM) 고해상도 및 최소한-침략 적 방식으로 생물학 구조에서 체적 데이터를 취득할 수 있는 새로운 바이오 이미징 양식 적임 이다. 이 연구의 목적은 multiphoton 현미경에 vivo에서 calvarial 중요 한 뼈 결함 수리에 대 한 유전자 변형된 3D-PLGA/nHAp 비 계에 신생을 시각화 했다. PLGA/nHAp 건설 기계 했다 공업화 신생을 촉진 하 고 뼈 재생을 향상 하려면 lentiviral 벡터 (LV-pdgfb)를 들고 성장 인자 pdgf b 유전자의 지속적인된 납품에 대 한. 비 계 이식 calvarial 중요 한 뼈에서 마우스 모델을 결함, PHp 건설 기계에서 혈관 영역 (BVAs) PH 건설 기계에서 보다 훨씬 더 높은 했다. 또한, pdgf b 와 신생 관련 유전자, vWF 및 VEGFR2의 식을 대응 하 게 증가 했다. MicroCT 분석 새로운 뼈 형성을 극적으로 향상 PHp 그룹에서 다른 그룹에 비해 표시. 우리의 지식, 이것은 multiphoton 현미경 조사는 3 차원 생물 분해성 scaffold에서 vivo에서 및 실시간으로 신생 뼈 조직 공학에 사용 되었다 처음으로.

Introduction

뼈는 개별¹의 수명 기간 동안 개장 하 고 매우 vascularized 조직 이다. 큰 뼈 결함 없앤 외상, 종양 절제, 또는 craniofacial 기형 발생의 신속 하 고 효과적인 뼈 재생 복잡 한 생리 적 과정 이다. 뼈 결함 수리를 위해 사용 하는 전통적인 치료 접근 포함 autograft와 이식 이식, 하지만 그들의 사용을 포함 여러 문제 및 제한 사항, 제한 된 가용성, 중요 한 기증자 사이트 병 적 상태, 감염의 위험이 높은 고 면역 거부^2,3호스트. 그러나, 인공 뼈 이식 이러한 제한을 완화 하는 효율적인 대안을 제공 합니다. 그들은 생 분해성 소재로 만들어질 수 있다, 적당 한 기 공 크기, 조작 하기 쉬운 하 고 유전자 변형된^4,5일 수 있다.

현재, 다양 한 조직 엔지니어링 건설 기계 조직 공학 뼈^6,7의 개발에 고용 되었다 있다. 뼈 수리 및 재생을 보다 효과적으로 유도 하기 위해 설계 된 바이오 성장 인자와 함께 등장 있고 달성 좋은 결과^8,9. 불행 하 게도, 짧은 반감기, 잃게 쉬운 활동 및 치료 효능에 대 한 성장 인자의 supraphysiological 복용량 그들의 임상 응용 프로그램¹⁰을 제한합니다. 이러한 문제를 해결 하려면 대신 성장 인자 성장 인자 유전자의 뼈가 있는 결함과 질병^11,12의 치료에 대 한 bioactivity를 유지 하는 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 바이러스 성 벡터는 유망한 납품 효율성¹³를 표현 하는 그들의 높은 인해 조직 재생에 대 한 도구.

성장 요인 중 혈소판 파생 된 성장 인자 (PDGF-BB)에서 선정 되었다이 연구는 물질과 엽 고 osteogenic 셀, chemoattractant 뿐만 아니라 신생^14,15 에 대 한 자극 제 이기 때문에 . 이전 전 임상 및 임상 연구는 PDGF BB 홍보할 수 있는 안전 하 고 효과적으로 잇 몸 뼈가 있는 결함^16,17뼈 수리 했다. 최근 연구 PDGF BB 동기 부여 내 피 세포 이동과 확산 vivo에서^18,19신생을 자극 한다는 것을 밝혔다. 또한, PDGF BB 렌더링할 수 있습니다 또한 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 내 피 세포²⁰, 그리고이 더 하이라이트에 neovascularization에서 MSCs의 잠재적인 역할을 차별화 할 수 있습니다. 따라서, 맥 관 구조 건설 기계 PDGF BB와에 드 노 보 형성 유도 뼈 조직 공학에서 공중 발판으로 성장 하는 조직의 수리를 위해 중요 한 단계입니다.

뼈 결함 치유 조정된 골 및 신생 수리 위치²¹에서 요구 하는 동적 조직 전체적 프로세스입니다. 이식된 조직 설계 건설 기계에 Neoangiogenesis 영양분 및 산소 성장 및 생존 및 변화 낭비를 제거 하기 위한 세포 공급에 대 한 필수적인 전제입니다. 일반적으로 사용 하는 이미징 방법, 엑스레이 포함 하 여 마이크로-계산 단층 (microCT), 자기 공명 영상 (MRI), 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 그리고 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대신 적용 됩니다. 신생 정보^22,23를 조직학 검사. 그러나, 이러한 방법을 시각화 및 뼈 조직 공학에서 3D 건설 기계에 neovasculature 측정에 다양 한 장애물의 얼굴. Multiphoton 현미경 (MPM)는 동시에 세포, 세포 외 기질, 시각화 및 주변 혈관 네트워크의 뚜렷한 장점이 비교적 새로운 바이오 이미징 기술 vivo에서. 그것은 깊은 조직 침투에 대 한 고유의 3 차원 이미징 능력을 소유 하 고 낮은 photodamage 발생. 따라서, 지난 10 년간, MPM 생물 의학 연구²⁴, 신경 과학, 면역학, 줄기 세포 역학 등에서 많은 관심을 얻고 있다. 그러나, 그것은 거의 정형 외과 연구에 사용 됩니다.

Protocol

동물 보호 관리 및 사용의 실험실 동물의 광 동성에 대 한 가이드 준수 했다. 모든 절차는 감독 및 동물 연구, 심천 연구소의 첨단 기술, 과학의 중국 아카데미에 대 한 윤리 위원회의 승인 아래 수행 했다. 1. lentiviral (LV) 생산 Spe를 사용 하 여 세포 발기인의 하류 lentiviral 식 벡터 (pLenti6/5-eGFP 또는 LV eGFP)에 사용자 지정 다중 복제에 pdgf b cDNA 클론 사이트 나 고 샐 …

Representative Results

원통형 다공성 PLGA/nHAp 투어 높이 0.6 m m와 4mm 직경에서 3D 프린터 조작 했다. 장비의 형태학 스캐닝 전자 현미경과 microCT를 통해 분석 되었다. 그림 1A 이식된 발판의 사진을 보여줍니다. MicroCT 검색 공개 숨 구멍의 85% 이상 크기 200에서 400 µ m (그림 1B)에 배열 했다. Sem의 영상 시연 발판의 표면 (그림 1의 D-F) 건설 기계 내부 ?…

Discussion

뼈는 지속적으로 치유 하 고 개별¹의 일생 내내 개장 독특한 용량 매우 vascularized 조직 이다. Vascularization의 레벨은 골 및 결함 수리를 위해 중요 하다. 낮은 vascularization 조직 공학 뼈의 넓은 임상 응용 프로그램을 제한합니다. 건설 biomimetics의 이론에 따르면 매우 vascularized 조직 공학 뼈 큰 세그먼트 뼈 결함을 복구 하기 위한 도구가 되고있다. 장비의 다양 한 종류는 비교적 작은 ?…

Materials

Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA)	Sigma	P1941	L/G ratio 75:25, MW 66000-107000
Hydroxyapatite nanoparticles	Sigma	702153	Average diameter < 200nm
Chloroquine diphosphate salt	Sigma	C6628
FITC-conjugated 250-kD dextran	Sigma	FD250S
1,4-dioxane	lingfeng,Shanghai		0.45 micron
Stericup filters	Merck Millipore Corporation	SLHV033RB
PDGF-BB Cdna	Sino Biological, Inc	MZ50801-G
Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody	BioVision, Inc	5489-30T
PDGF-BB recombinant protein		4489-50
Calcium-phosphate transfection solution	Promega Corporation	E1200
L-DMEM	Hyclone	SH30021.01
DPBS	Hyclone	SH30028.01
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Thermo Fisher Scientific	15140122
FBS	Thermo Fisher Scientific	10099-141
Transwell	Corning	3422
Male BALB/c mice	Guangdong Medical Laboratory Animal Center
sodium pentobarbital	Merck	1063180500
multiphoton microscopy			A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG).
isoflurane	Keyuan, Shandong	401750169
TRIzol reagent	Invitrogen	15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	Takara	RR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR036B
Hematoxylin and eosin	Beyotime	C0105
Paraffin	Leica	RM2235
Ultracentrifuge OPtima L-100XP	Beckman Coulter	L-100XP
Low-temperature printer	Tsinghua university		A homemade in Tsinghua university
LightCycler 480 instrument	Roche	5815916001
microCT	Bruker	1176
commercial software	Bruker