Visualisere angiogenese av Multiphoton mikroskopi I Vivo i genmodifiserte 3D-PLGA/nHAp stillaset Calvarial kritisk bein defekt reparasjon
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å visualisere blodkar formasjonen i vivo og i sanntid i 3D stillaser av multiphoton mikroskopi. Angiogenese i genmodifiserte stillaser ble studert i murine calvarial kritisk bein feil modell. Flere nye blodkar ble oppdaget i behandling gruppen enn i kontroller.
Abstract
Gjenoppbygging av kritisk størrelse bein mangler forblir en alvorlig klinisk problem på grunn av dårlig angiogenese i vev-konstruert stillaser under reparasjon, som gir opphav til en mangel på tilstrekkelig blodtilførsel og fører til nekrose av nye vev. Rask endometrial blodkar er en viktig forutsetning for nye vev overlevelse og integrasjon med eksisterende vert vev. De novo generering av blodkar i stillasene er en av de viktigste trinnene i å gjøre bein gjenfødelse mer effektivt, slik at reparasjon vev til å vokse til et stillas. For å håndtere dette problemet, brukes den genetisk modifisering av en biomateriale stillaset å akselerere angiogenese og osteogenesis. Imidlertid er visualisere og spore i vivo blodkar formasjonen i sanntid og tredimensjonale (3D) stillaser eller nye benvev fortsatt en hindring for bein vev engineering. Multiphoton mikroskopi (MPM) er en roman bio-imaging modalitet som kan skaffe volumetriske data fra biologiske strukturer på en høy oppløsning og minimal-invasiv måte. Målet med denne studien var å visualisere angiogenese med multiphoton mikroskopi i vivo i en genetisk modifisert 3D-PLGA/nHAp stillaset calvarial kritisk bein defekt reparasjon. PLGA/nHAp stillaser var functionalized for vedvarende levering av et vekstfaktor pdgf-b gen bærer lentiviral vektorer (LV –pdgfb) for å lette angiogenese og å styrke bein gjenfødelse. I et stillas-implantert calvarial kritisk bein defekt musemodell, blodkar områder (BVAs) i PHp stillaser var betydelig høyere enn i PH stillaser. I tillegg økt uttrykk for pdgf-b og angiogenese-relaterte gener, vWF og VEGFR2, tilsvarende. MicroCT analyse indikerte at nye bein dannelsen i gruppen PHp dramatisk forbedret i forhold til andre grupper. Vi vet er dette første gang multiphoton mikroskopi ble brukt i bein vev utvikling for å etterforske angiogenese i en 3D bio-nedbrytbar stillaset i vivo og i sanntid.
Introduction
Ben er en svært vascularized vev som fortsetter å remodel i løpet av en individuell1. Rask og effektiv benet fornyelse av store bein mangler fra traumer, nonunion, svulst resections eller craniofacial misdannelser er en kompleks fysiologisk prosess. Tradisjonelle behandlingsmetoder brukes for bein defekt reparasjon inkluderer autograft og allograft implantasjon, men bruken innebærer flere problemer og begrensninger som begrenset tilgjengelighet, betydelig donor området sykelighet, høy risiko for infeksjon, og vert uimottakelig avvisning2,3. Men tilbyr kunstig bein grafts et alternativ for å lindre disse begrensningene. De kan være laget av biologisk nedbrytbart materiale, er lett å være dikte med en egnet porestørrelse, og kan være genetisk modifisert4,5.
Foreløpig har ulike vev engineering stillaser vært ansatt i utviklingen av vev-konstruert Ben6,7. For å indusere bein reparasjon og regeneration mer effektivt, har konstruert biologisk materiale kombinert med vekstfaktorer dukket opp og oppnådd gode resultater8,9. Dessverre, kort halveringstid, lett å miste aktivitet og supraphysiological dosering av vekstfaktorer for terapeutiske effekten begrense deres klinisk anvendelse10. For å overvinne disse problemene, har levering av vekstfaktor gener i stedet for vekst faktorer vist som en effektiv tilnærming til å opprettholde bioactivity for behandling av osseous feil og sykdommer11,12. Viral vektorer er lovende levering verktøy for vev gjenfødelse på grunn av sin høye uttrykke effektivitet13.
Blant vekstfaktorer, ble blodplater-avledet vekst faktor (PDGF-BB) valgt i denne studien fordi det er ikke bare en mitogen og chemoattractant for mesenchymal og osteogenic celler, men også en stimulerende for angiogenese14,15 . Tidligere prekliniske og kliniske studier viste at PDGF-BB kan trygt og effektivt fremme bein reparasjon i periodontal osseous feil16,17. Nyere studier viser at PDGF-BB stimulerer angiogenese av motiverende endothelial celle migrasjon og spredning i vivo18,19. Videre kan PDGF-BB også gjengi stamceller (MSCs) i stand til å skille i endotelceller20, og denne flere høydepunkter MSCs potensielle rolle i neovascularization. Derfor er inducing de novo dannelsen av blodkar i stillaser med PDGF-BB et viktig skritt for reparasjon av vev vokst til stillaser i bein vev engineering.
Bein defekt healing er en dynamisk vev Morfogenetiske prosess som krever koordinert osteogenesis og angiogenese på reparere posisjoner21. Neoangiogenesis i implantert vev-konstruert stillasene er en viktig forutsetning for å forsyne celler med næringsstoffer og oksygen for vekst og overlevelse og fjerner metabolske avfall. Brukte imaging metoder, beregnet inkludert X-ray mikro-tomografi (microCT), magnetisk resonans imaging (MRI), skanning elektronmikroskop (SEM), optical coherence tomografi (OCT) og AC confocal laserskanning mikroskopi, brukes i stedet for histologiske undersøkelser for angiogenese informasjon22,23. Men møte metodene ulike hindringer i visualisere og måler neovasculature i 3D stillaser i bein vev engineering. Multiphoton mikroskopi (MPM) er en relativt ny bio-tenkelig teknikk som har klar fordel av å visualisere celler, ekstracellulær matrix, og rundt vaskulære nettverk samtidig i vivo. Det har en iboende tredimensjonale imaging evnen for dype vev penetrasjon og forårsaker lav photodamage. Derfor, i det siste tiåret, MPM har fått mye oppmerksomhet i biomedisinsk studier24, inkludert i nevrovitenskap, immunologi og stamcelleforskningen dynamics. Men er det knapt brukt i Ortopedisk forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ben er en svært vascularized vev med en unik evne til å helbrede og renovere av en individuell1kontinuerlig. Endometrial blodkar er viktig for osteogenesis og defekt reparasjon. Lav endometrial blodkar begrenser bredt klinisk anvendelse av vev-konstruert ben. Konstruere en svært vascularized vev-konstruert Ben ifølge teorien om biomimetics har blitt et verktøy for å reparere stort segment bein mangler. Ulike typer stillasene er vellykket brukt for å reparere forholdsvis lite osseous mangler…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Shenzhen Peacock programmet, Kina (nr. 110811003586331), Shenzhen grunnleggende forskningsprogrammet (nr. JCYJ20150401150223631, nr. JCYJ20150401145529020 og nr. JCYJ20160331190714896), Guangdong offentlig forskning og kapasitetsbygging spesielle programmet (nr. 2015A020212030), National Natural Science Foundation i Kina (nr. 81501893), National Major Basic forskningsprogrammet Kina (2013CB945503), og Netthinnen innovasjon Program for utmerket unge forskere (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
