Visualisera angiogenes av Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetiskt modifierade 3D-PLGA/nHAp byggnadsställning för Calvarial kritiska ben defekt reparation
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera blodkärl bildas i vivo och i realtid i 3D ställningar av multiphoton mikroskopi. Angiogenes i genetiskt modifierade ställningar studerades i en murina calvarial kritiska ben defekt modell. Fler nya blodkärl upptäcktes i behandlingsgruppen än i kontroller.
Abstract
Återuppbyggnaden av kritiskt storlek ben defekter förblir ett allvarligt kliniska problem på grund av dålig angiogenes inom vävnadstekniska ställningar under reparation, vilket ger upphov till en brist på tillräcklig blodtillförsel och orsakar nekros av nya vävnader. Snabb vaskularisering är en avgörande förutsättning för ny vävnad överlevnad och integration med befintliga värden vävnad. De novo generering av kärlsystemet i ställningar är en av de viktigaste stegen i att effektivisera ben, vilket gör att reparera vävnad att växa till en byggnadsställning. För att tackla detta problem, används genmodifiering av en biomaterial byggnadsställning för att påskynda angiogenes och osteogenesis. Men, visualisera och spåra i vivo blodkärlsbildning i realtid och tredimensionella (3D) ställningar eller ny benvävnad är fortfarande ett hinder för bone tissue engineering. Multiphoton mikroskopi (MPM) är en roman bio-imaging modalitet som kan förvärva volymetriska data från biologiska strukturer i ett högupplöst och minimalinvasiv sätt. Syftet med denna studie var att visualisera angiogenes med multiphoton mikroskopi i vivo i en genetiskt modifierade 3D-PLGA/nHAp byggnadsställning för calvarial kritiska ben defekt reparation. PLGA/nHAp ställningar var functionalized för fortsatt leverans av en tillväxtfaktorn pdgf-b gen bär lentiviral vektorer (LV –pdgfb) för att underlätta angiogenes och att förbättra ben. I en byggnadsställning-implanterade calvarial kritiska ben defekt musmodell, blodkärl områdena (BVAs) i PHp ställningar var betydligt högre än i PH ställningar. Dessutom ökar uttrycket av pdgf-b och angiogenes-relaterade gener, vWF och VEGFR2, på motsvarande sätt. MicroCT analys visade att den nya benbildningen i gruppen PHp förbättrats dramatiskt jämfört med de andra grupperna. Till vår kunskap är detta första gången multiphoton mikroskopi användes i ben vävnadsteknik för att undersöka angiogenes i en 3D biologiskt nedbrytbar byggnadsställning i vivo och i realtid.
Introduction
Ben är en högt vaskulariserad vävnad som fortsätter att renovera under livstiden för en enskild1. Snabba och effektiva ben regenerering av stort ben defekter som följd av trauma, avsaknad av hopläkning, tumör resektioner eller kraniofaciala missbildningar är en komplex fysiologisk process. Traditionella behandlingsmetoder som används för ben defekt reparation inkluderar autograft och transplantatavstötning implantation, men deras användning innebär flera problem och begränsningar, såsom begränsad tillgänglighet, betydande givare webbplats sjuklighet, en hög risk för infektion, och värd för immun avslag2,3. Konstgjorda bone Transplanterad läderhud erbjuder dock ett effektivt alternativ för att lindra dessa begränsningar. De kan vara gjorda av biologiskt nedbrytbara material, är lätt att vara tillverka med en lämplig porstorlek och kan vara genetiskt modifierade4,5.
För närvarande har olika tissue engineering ställningar varit anställd i utvecklingen av vävnadstekniska ben6,7. Inducera ben reparation och förnyelse mer effektivt, har konstruerade biomaterial kombinerat med tillväxtfaktorer uppstått och uppnått goda resultat8,9. Tyvärr, den kort halveringstid, lätt-till-förlora aktivitet och suprafysiologiska dosering av tillväxtfaktorer för terapeutisk effekt begränsa deras klinisk tillämpning10. För att övervinna dessa problem, har leverans av tillväxtfaktor gener istället för tillväxtfaktorer påvisats som ett effektivt tillvägagångssätt att upprätthålla bioaktivitet för behandling av bendefekter och sjukdomar11,12. Virala vektorer är lovande leverans verktyg för vävnadsregeneration på grund av sin höga uttrycker effektivitet13.
Bland tillväxtfaktorer valdes trombocyt-derived tillväxt factor (PDGF-BB) i denna studie eftersom det är inte bara en mitogen och korrektiv för mesenkymala och Osteogena celler, men också en stimulerande för angiogenes14,15 . Tidigare prekliniska och kliniska studier visade att PDGF-BB kunde säkert och effektivt främja ben reparation i parodontala bendefekter16,17. Senare studier visade att PDGF-BB stimulerar angiogenes av motiverande endotelceller migration och spridning i vivo18,19. Dessutom kan PDGF-BB även återge mesenkymala stamceller (MSC) kan differentiera till endotelceller20och detta ytterligare höjdpunkter MSCs potentiella roll i kärlnybildning. Därför är förmå de novo bildandet av kärlsystemet i ställningar med PDGF-BB ett viktigt steg för att reparera vävnad vuxit till byggnadsställningar i ben vävnadsteknik.
Benläkning defekt är en dynamisk vävnad morphogenetic process som kräver samordnade osteogenesis och angiogenes vid reparation positioner21. Neoangiogenesis in implanterade vävnadstekniska ställningar är en grundläggande förutsättning för att förse cellerna med näring och syre för tillväxt och överlevnad och för att avlägsna metabola avfall. Vanligen används imaging metoder, beräknade inklusive röntgen mikro-datortomografi (microCT), magnetisk resonanstomografi (MRT), scanning electron microscopy (SEM), optisk koherenstomografi (OCT) och confocal laserscanning mikroskopi, tillämpas i stället för Histologisk undersökning att få angiogenes information22,23. Dock möter dessa metoder olika hinder i visualisera och mäta neovasculature i 3D ställningar i ben vävnadsteknik. Multiphoton mikroskopi (MPM) är jämförelsevis ny bio-imaging teknik som har den klara fördelen samtidigt visualisera celler, extracellulär matrix, och omgivande vaskulär nätverk invivo. Det äger en inneboende tredimensionell avbildning förmåga för djup vävnad penetration och orsakar låg photodamage. Därav, under det senaste decenniet, MPM har fått mycket uppmärksamhet i biomedicinska studier24, inklusive i immunologi, neurovetenskap och stamceller dynamics. Det används dock knappt i ortopedisk forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ben är en högt vaskulariserad vävnad med en unik förmåga att kontinuerligt läka och renovera under hela livstiden för en enskild1. Vaskularisering är viktigt för osteogenesis och defekt reparation. Låg vaskularisering begränsar bred klinisk tillämpning av vävnadstekniska ben. Att bygga ett högt vaskulariserad vävnad-engineered ben enligt teorin om Biomimetik har blivit ett verktyg för att reparera stora segment ben defekter. Olika typer av ställningar har tillämpats framgångsrik…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Shenzhen Peacock programmet, Kina (nr. 110811003586331), Shenzhen grundläggande forskningsprogrammet (nr. JCYJ20150401150223631, Nr. JCYJ20150401145529020, och nej. JCYJ20160331190714896), Guangdong offentlig forskning och kapacitetsuppbyggnad särskilda programmet (nr 2015A020212030), National Natural Science stiftelsen Kina (nr. 81501893), National Major Basic forskningsprogrammet Kina (2013CB945503), och SIAT innovationsprogram för excellenta unga forskare (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
References
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
