Rilevamento e l'arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l'analisi del fenotipo e funzione
Summary
Un metodo semplice ma efficace che si avvale di nanoparticelle magnetiche per rilevare e arricchire le cellule B antigene-reattiva per l'analisi funzionale e fenotipica è descritto.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Diluizione limite analisi di frequenza precursore cellule che secernono anticorpi hanno suggerito che le cellule B reattive ad un particolare antigene tipicamente si verificano ad una frequenza da 0,05 a 0,005% nel repertorio normale, a seconda dello stato di vaccinazione e dimensione / numero di epitopi presenti sul antigene. La bassa frequenza di queste cellule ha reso difficile per studiare i cambiamenti della loro situazione durante lo sviluppo di risposte immunitarie, ad esempio dopo la vaccinazione o l'esposizione ad un antigene estraneo, o durante lo sviluppo di autoimmunità. In precedenza, i ricercatori hanno intrapreso isolamento delle cellule B antigene-reattiva utilizzando tecniche che variano da piastre rivestite con antigene o adsorbenti colonne, per l'antigene rivestite riarmo globuli rossi, alla cella di smistamento 1, 2, 3, 4, 5, 6 fluorescenza attivato. though queste tecniche sono riusciti ad identificare e isolare cellule B antigene-reattiva, i risultati hanno variato in termini di resa, purezza e scalabilità. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per rilevare sia e arricchire rari sottopopolazioni di linfociti B utilizzando nanoparticelle magnetiche. Il metodo consente di arricchimento relativamente elevata resa e purezza da grandi popolazioni di partenza, ed è compatibile con l'analisi di risposte alla antigene. Arricchendo da popolazioni di cellule in sospensione, il metodo elimina vincoli associati con la geometria delle lastre o colonne antigene rivestite e produttività limite. Infine, poiché le cellule arricchiti rimangono associate antigene e un reporter fluorescente, possono essere ulteriormente purificati mediante FACS ordinamento. Come descritto qui abbiamo usato questo approccio per lo studio delle cellule B periferiche tetano sangue tetanico-reattiva, prima e dopo l'immunizzazione di soggetti umani, così come le cellule B autoantigenici-reattiva da soggetti con varie autoidisturbi mmune, tra cui diabete di tipo 1, malattia di Graves ', e la malattia di Hashimoto 7. Il metodo funziona ugualmente bene in topo e umano, ed è compatibile con l'analisi di cellule B antigene-reattiva da una varietà di tessuti (manoscritto in preparazione).
Nel suo formato di base, cellule mononucleate del sangue periferico vengono prima incubate con l'antigene biotinilato con anticorpi di cella antigeni di superficie richiesti per l'analisi fenotipica. Questa fase di etichettatura è seguita da lavaggio e fissaggio, e l'aggiunta di streptavidina accoppiata al colorante rosso lontano fluorescente per il rilevamento della cellule vincolante biotinilato-antigene (Figura 1). Precedenti studi hanno identificato cellule B antigene-specifiche in modo simile, ma utilizzando antigeni direttamente coniugato ad un fluorocromo 8, 9, 10, 11. Anche se questo è un degnoapproccio, l'uso di antigeni biotinilati in combinazione con streptavidina consente una maggiore amplificazione del segnale (quindi una migliore differenziazione delle cellule vincolanti e non vincolanti), in particolare quando gli antigeni sono piccole 12, 13, 14. Un'ulteriore considerazione è l'uso di streptavidina invece di avidina perché streptavidina è deglicosilata, diminuendo legame non specifico. Inoltre, usiamo colorante far-rosso fluorescente come il fluorocromo a causa della sua fotostabilità, rendimento quantico (luminosità), e le sue piccole dimensioni (~ 1,3 KD). Fluorocromi proteine come ficoeritrina (~ 250 kD) e allophycocyanin (~ 105 kD) 15 non sono ottimali perché contengono potenzialmente molti epitopi antigenici. Uso di un piccolo colorante fluorescente biologico composto di un singolo epitopo, come colorante rosso lontano fluorescente, riduce la complessità della popolazione di cellule isolate.
Una volta che le cellule sono biotinilati-antigen e adsorbito lontano-rosso-colorante fluorescente-streptavidina, sono arricchiti con anti-far-rosso-fluorescenti nanoparticelle magnetiche colorante coniugato. Nanoparticelle singole non vengono rilevati dalla maggior parte dei citometri a flusso e quindi non devono essere rimossi prima di purificazione per FACS ordinamento e saggi a valle 16. Selezione magnetico per cellule B antigene-specifiche arricchisce la popolazione di interesse, eliminando i tempi ei costi di classificare gli eventi rari usando un citometro a flusso.
Qui di seguito vi mostriamo i risultati rappresentativi di arricchimento delle cellule B-specifici tetano-tetanico un soggetto prima e sette giorni dopo tetano richiamo di immunizzazione. Abbiamo scelto questa particolare applicazione come esempio per dimostrare la capacità di questo metodo per arricchire cellule B antigene-specifiche seguenti acuta nella stimolazione vivo. Una volta accoppiato con citometria a flusso, questo metodo è in grado di arricchire e differenziare antigene-specifica naive, la memoria, ecellule plasmablast B e consente al ricercatore di seguire i cambiamenti nella loro frequenza nel corso del tempo. Inoltre, includiamo un'altra possibile test a valle, ad esempio, un saggio ELISPOT, il che dimostra che le cellule mantengono la capacità di secernere anticorpi a seguito di arricchimento. Un'altra applicazione di questo metodo potrebbe comportare il trasferimento adottivo di cellule arricchite in un ospite. Abbiamo precedentemente dimostrato cellule mantengono la capacità di agire come cellule presentanti l'antigene alle cellule T antigene-specifiche seguenti isolamento e di trasferimento (dati non riportati). Quindi, ci sono una serie di possibili saggi a valle che potrebbero essere accoppiati al metodo, che informa insieme la comprensione della risposta immunitaria antigene-specifica. Abbiamo descritto il metodo di seguito, inclusi i controlli per determinare la resa complessiva, la purezza, la specificità delle cellule, e piegare-arricchimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un nuovo metodo per realizzare l'isolamento e arricchimento delle cellule B antigene vincolante da sangue periferico umano. Il metodo è facilmente applicabile a topi e ad altri tessuti, come i milza e nei linfonodi, ed è compatibile con l'analisi post-arricchimento del fenotipo cellulare e funzione (manoscritto in preparazione).
L'utente deve essere a conoscenza di un certo numero di variabili che possono influenzare il successo di questa procedura. Per esperien…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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