표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포
Summary
기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
제한 희석하여 항체 – 분비 세포의 전구체 빈도 분석은 특정 항원에 대한 반응성 B 세포는 통상적으로 접종 상태 및 항원 상에 존재하는 항원의 크기 / 수에 따라, 통상의 레퍼토리 0.05 % 내지 0.005의 주파수에서 발생하는 것을 제안했다. 이러한 세포의 낮은 주파수는 어려운 등 외국 항원, 또는자가 면역의 개발 기간 동안 다음과 같은 예방 접종 또는 노출과 같은 면역 반응의 개발 기간 동안 자신의 상태 변화를 연구했다. 이전 연구자가 항원 – 코팅 된 적혈구 리셋 항원 코팅 된 플레이트 또는 열 흡착제로부터 레인 징 기술을 사용하여 항원 – 반응성 B 세포의 분리 맡은 1, 2, 3, 4, 5, 6 정렬 셀을 형광 – 활성화. Thoug이러한 기술은 항원 – 반응성 B 세포를 식별 분리에 성공했다 (H)는, 그 결과 수율, 순도 및 확장 성면에서 다양하다. 최근에 우리는 모두 감지하고 자기 나노 입자를 사용하여 희귀 한 B 림프구의 소집단을 풍부하게 할 수있는 새로운 방법을 개발했다. 이 방법은 큰 시작 인구에서 상대적으로 높은 수율과 순도 농축 수, 항원에 대한 반응의 분석과 호환됩니다. 현탁액 중의 세포의 집단에서 농축함으로써, 상기 방법은 항원 – 코팅 된 플레이트 또는 열 및 제한 처리량의 구조와 관련된 제약을 제거한다. 농축 된 세포가 항원과 형광 리포터와 관련된 남아 보낸 마지막으로, 이들은 더 FACS 분류에 의해 정제 할 수있다. 여기에 설명 된 바와 같이 우리는 다양한 autoi와 과목에서이 전 말초 혈액 파상풍 톡소이드 반응성 B 세포의 연구와 인체의 다음과 같은 예방 접종에 대한 접근뿐만 아니라,자가 항원 반응 B 세포를 사용했다제 1 형 당뇨병, 그레이브스 병, 하시모토 병 (7)을 포함 mmune 장애. 상기 방법은 마우스 및 인간에서 동일하게 작동하며, 다양한 조직 (제조에서 원고)에서 항원 – 반응성 B 세포 분석과 호환된다.
기본적인 형태로, 말초 혈 단핵 세포를 제 표현형 분석에 필요한 표면 항원 셀하는 항체와 함께 비오틴 항원과 함께 배양된다. 이 라벨링 단계는 세척 및 고정을 한 세포를 결합 오티 닐화 항원 (도 1)의 검출 원적외선 형광 색소에 결합 된 스트렙 타비 딘을 첨가하여된다. 이전 연구와 유사한 방식으로 항원 특이 적 B 세포를 확인했지만하여 항원 직접 형광 색소 8, 9, 10, 11에 접합. 이 가치이지만방법은 스트렙 타비 딘과 함께 오티 닐화 항원의 사용은 항원 12, 13, 14 작을 때 특히 큰 신호 증폭 (결합 및 비 결합 따라서 세포보다 분화)을 가능하게한다. 추가적인 고려는 스트렙 타비 딘 대신 스트렙 아비딘이 탈글 라이코 실화 때문에, 비특이적 결합을 감소의 사용이다. 또한, 우리는 때문에, 양자 수율 (밝기)의 광 안정성, 그리고 작은 크기 (~ 1.3 kD의)에 형광 색소까지 붉은 형광 염료를 사용합니다. 그들은 잠재적으로 많은 항원 에피토프를 포함하기 때문에 단백질 등의 피코 에리 트린과 같은 형광 색소 (~ 250 kD의)와 알로 (~ 105 kD의) (15)는 최적되지 않습니다. 이러한 원적외선 형광 염료 단일 에피토프로 구성된 작은 유기 형광 염료의 사용은 분리 된 세포 집단의 복잡성을 감소시킨다.
세포가되면 바이오틴-Antigen과 멀리 붉은 형광 염료 스트렙 타비 딘 흡착는, 그들은 안티 – 원적외선 형광 염료 복합 자성 나노 입자를 사용하여 농축된다. 단일 나노 입자는 대부분의 유동 세포 계측기에 의해 검출되지 않고, 따라서 정렬 하류 FACS 분석 (16)에 의해 정제하기 전에 제거 할 필요가 없다. 항원 특이 적 B 세포의 자기 선택은 시간 및 플로우 사이토 미터를 사용하여 희귀 이벤트를 분류 비용을 제거 관심 집단을 풍부.
우리는 이전과 칠일 파상풍 톡소이드 부스터 예방 접종 후 대상에서 파상풍 톡소이드 – 특정 B 세포의 농축 대표 결과를 보여 아래. 우리 생체 자극 급성 다음 항원 특이 적 B 세포 농축이 방법의 기능을 설명하기 위해 예로서, 특정 프로그램을 선택했다. 유동 세포 계측법에 결합하면,이 방법은 농후하고 분화 항원 특이 나이브 메모리 할 수 있고,plasmablast B 세포와는 연구자가 시간이 지남에 따라 빈도의 변화를 수행 할 수 있습니다. 또, 예를 들면 세포가 농축 다음 항체를 분비하는 능력을 유지하는 것을 보여주는 ELISPOT 분석, 다른 가능한 하류 분석을 포함한다. 이 방법의 또 다른 응용 프로그램은 호스트에 풍부한 세포의 입양 전송을 포함 할 수있다. 우리는 이전에 세포를 분리 및 전송 다음 항원 특이 적 T 세포에 항원 제시 세포로 역할을 할 수있는 능력을 유지 보였다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 함께 항원 특이 적 면역 반응의 이해를 알리는 방법으로 결합 될 수있는 가능한 하류 분석법 수있다. 우리는 전체 수율, 순도, 세포의 특이성을 결정하고, 배 농축을하는 컨트롤을 포함하는 방법을 설명했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 고립과 인간의 말초 혈액에서 항원 결합 B 세포의 농축을 달성하기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 상기 방법은 생쥐 비장 및 림프절과 같은 다른 조직을 용이하게 적용 가능하며, 세포의 표현형 및 기능 (준비 원고)의 후 농축 분석과 호환된다.
사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수있는 변수의 수를 인식해야한다. 경험에서 죽은 세포가 아닌 특정 증?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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