Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion
Summary
Eine einfache aber wirksame Methode, die magnetischen Nanopartikel verwendet antigen-reaktiven B-Zellen für die funktionale und phänotypische Analyse zu erfassen und zu bereichern beschrieben.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
bei einer Frequenz von 0,05 bis 0,005% in dem normalen Repertoire Analysen von Antikörper-sezernierenden Zellvorläuferfrequenz limitierende Verdünnung haben vorgeschlagen, dass B-Zellen reaktive typischerweise auf ein bestimmtes Antigen auftreten, je nach der Impfung Status und Größe / Anzahl der Epitope auf dem Antigen vorhanden. Die geringe Häufigkeit dieser Zellen hat es schwierig gemacht, Veränderungen in ihren Status während der Entwicklung von Immunantworten zu untersuchen, beispielsweise nach der Impfung oder der Exposition gegenüber einem fremden Antigen oder während der Entwicklung der Autoimmunität. Früher haben Forscher Isolierung von Antigen-reaktiven B – Zellen im Bereich von Adsorbentien Antigen beschichteten Platten oder Säule unter Verwendung von Techniken durchgeführt, um Antigen-beschichteten Rücksetzen der roten Blutkörperchen, um fluoreszenzaktivierte Zellsortierung 1, 2, 3, 4, 5, 6. though Diese Techniken wurden erfolgreich bei der Identifizierung und Isolierung von Antigen-reaktiven B-Zellen, wurden die Ergebnisse hinsichtlich der Ausbeute, Reinheit und Skalierbarkeit variiert. Kürzlich haben wir ein neues Verfahren, um sowohl zu erkennen und seltenen B-Lymphozyten-Subpopulationen mittels magnetischer Nanopartikel anreichern. Das Verfahren ermöglicht mit relativ hoher Ausbeute und Reinheit aus großen Populationen Ausgangs Anreicherung und ist mit der Analyse von Antworten auf Antigen-kompatibel. Durch die Anreicherung von Populationen von Zellen in Suspension, beseitigt das Verfahren Einschränkungen, die mit der Geometrie von Antigen-beschichteten Platten oder Säulen und Grenzdurchsatz verbunden sind. Da schließlich angereicherten Zellen mit Antigen und einem fluoreszierenden Reporter verbunden bleiben, können sie weiter durch FACS-Sortierung gereinigt werden. Wie hierin beschrieben, haben wir diesen Ansatz für die Untersuchung von peripheren Blut-Tetanustoxoid-reaktiven B-Zellen vor und nach der Immunisierung von menschlichen Subjekten, sowie Autoantigen-reaktiven B-Zellen von Patienten mit verschiedenen autoi verwendetmmune Störungen, einschließlich Typ – 1 – Diabetes, Morbus Basedow und Hashimoto-Krankheit 7. Das Verfahren arbeitet gleichermaßen gut in Maus und Mensch, und ist kompatibel mit der Analyse von Antigen-reaktiven B-Zellen aus einer Vielzahl von Geweben (Manuskript in Vorbereitung).
In ihrem Grundformat, peripheren mononukleären Blutzellen zuerst mit biotinyliertem Antigen mit Antikörpern inkubiert Oberflächenantigene für die phänotypische Analyse erforderlich zu Zelle. Dieser Markierungsschritt wird durch Waschen und Fixierung , gefolgt, und die Zugabe von zu fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff zum Nachweis des biotinylierten Antigen gekoppeltem Streptavidin bindenden Zellen (Abbildung 1). Frühere Studien haben antigenspezifischen B – Zellen in ähnlicher Weise identifiziert , aber unter Verwendung von Antigenen direkt konjugiert an ein Fluorochrom 8, 9, 10, 11. Obwohl dies ein würdigerAnsatz, die Verwendung von biotinylierten Antigenen in Verbindung mit Streptavidin ermöglicht eine größere Signalverstärkung ( und somit eine bessere Differenzierung von bindenden und nicht-bindenden Zellen), insbesondere , wenn Antigene sind kleiner 12, 13, 14. Eine weitere Überlegung ist die Verwendung von anstelle von Avidin Streptavidin da Streptavidin deglycosyliert wird, abnehmend unspezifische Bindung. Des weiteren verwenden wir Quantenausbeute (Helligkeit), und die geringe Größe (~ 1,3 kD) fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff als Fluorochrom aufgrund ihrer Photostabilität. Protein Fluorochrome wie Phycoerythrin (~ 250 kD) und Allophycocyanin (~ 105 kD) 15 sind nicht optimal , weil sie möglicherweise viele antigene Epitope enthalten. Die Verwendung eines kleinen organischen Fluoreszenzfarbstoff aus einem einzigen Epitop zusammengesetzt, wie weit Rot-Fluoreszenzfarbstoff, verringert die Komplexität der isolierten Zellpopulation.
Sobald Zellen biotinyliert-antigen und fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-Streptavidin adsorbiert, werden sie angereichert mit Anti-fernen Rot-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte magnetische Nanopartikel. Single – Nanopartikel werden von den meisten Durchflusszytometer detektiert und daher nicht vor der Reinigung durch FACS entfernt werden müssen Sortier- und Downstream – Assays 16. Magnetauswahl für antigen-spezifische B Zellen bereichert die Population von Interesse, wodurch die Zeit und Kosten für seltene Ereignisse Sortier eines Durchflusszytometers verwenden.
Im Folgenden zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus der Anreicherung von Tetanus-Toxoid-spezifischen B-Zellen aus einem Subjekt vor und sieben Tage nach der Booster-Immunisierung Tetanustoxoid. Wir haben uns für diese spezielle Anwendung als Beispiel , um die Fähigkeit dieser Methode zu demonstrieren , Antigen-spezifische B – Zellen nach einer akuten in vivo Stimulation zu bereichern. Wenn Cytometrie mit Strömungs gekoppelt ist dieses Verfahren anreichern können und differenzierantigenspezifischen naiven, Speicher undPlasmablasten B-Zellen und ermöglicht es dem Forscher Änderungen in ihrer Frequenz über die Zeit zu verfolgen. Zusätzlich umfassen wir eine weitere mögliche Downstream – Assay, beispielsweise einem ELISPOT – Assay, was zeigt , dass die Zellen die Fähigkeit zur Sekretion von Antikörper folgenden Anreicherungs beibehalten. Eine weitere Anwendung dieses Verfahrens könnte beinhalten adoptiven Transfer von angereicherten Zellen in einen Wirt. Wir haben zuvor gezeigt Zellen aufrechtzuerhalten, die Fähigkeit als Antigen zu wirken Zellen zu Antigen-spezifischen T-Zellen nach der Isolierung und Übertragung präsentiert (Daten nicht gezeigt). Daher gibt es eine Anzahl von möglichen stromabwärts Assays, die mit dem Verfahren verbunden werden könnten, die zusammen das Verständnis der antigenspezifischen Immunantwort informiert. Wir haben das nachfolgend beschriebene Verfahren, einschließlich der Kontrollen Gesamtausbeute, Reinheit, Zellspezifität zu bestimmen und zerlegbare Bereicherung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine neuartige Methode Isolierung und Anreicherung von Antigen-bindenden B-Zellen aus menschlichen peripheren Blut zu erreichen. Das Verfahren ist ohne weiteres auf Mäuse und zu anderen Geweben, wie die Milz und Lymphknoten, und ist kompatibel mit Nachanreicherung Analyse der Zell-Phänotyp und die Funktion (Manuskript in Vorbereitung).
Der Benutzer sollte in einer Anzahl von Variablen sein, die cognizant Erfolg dieses Verfahrens beeinflussen kann. Aus Erfahrung neigen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
