表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮
Summary
機能的および表現型分析のために、抗原反応性B細胞を検出し、豊かに磁性ナノ粒子を使用するシンプルで効果的な方法が記載されています。
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
限界希釈する抗体分泌細胞の前駆体頻度の分析は、特定の抗原に対して反応性B細胞は、典型的には、ワクチン接種の状態と抗原上に存在するエピトープのサイズ/数に応じて、通常のレパートリーは0.05〜0.005％の頻度で起こることを示唆しています。これらの細胞の低頻度は、それが難しいような外来抗原、または自己免疫の開発中に、次のワクチン接種または暴露のような免疫応答の開発中にその状態の変化を研究するために作られました。以前に、研究者らは、抗原被覆プレートまたはカラムの吸着剤から、抗原でコーティングされた赤血球のリセットに、1、2、3、4、5を蛍光活性化細胞選別、6の範囲の技術を用いて抗原反応性B細胞の単離を行っています。 Thougこれらの技術は、抗原反応性B細胞を同定及び単離に成功している時間は、その結果は、収率、純度およびスケーラビリティの点で変化しています。最近では、両方の検出および磁性ナノ粒子を用いた希少なBリンパ球亜集団を豊かにする新規な方法を開発しました。この方法は、大きな始動集団からの比較的高い収率および純度で濃縮を可能にし、抗原に対する応答の解析と互換性があります。懸濁液中の細胞の集団から豊かにすることで、この方法は、抗原をコーティングしたプレートまたは列、および限界スループットのジオメトリに関連付けられている制約を排除します。濃縮された細胞は、抗原および蛍光レポーターに関連付けられたままであるので、最終的に、彼らはさらに、FACS選別によって精製することができます。本明細書に記載するように、私たちは前に、末梢血破傷風トキソイド反応性B細胞の研究のために、このアプローチを使用し、様々なautoiを有する被験者からヒト被験者の免疫化、ならびに自己反応性B細胞を、次のしています1型糖尿病、バセドウ病、橋本病7を含むmmune障害、。この方法は、マウスおよびヒトで同様に動作し、種々の組織（原稿準備中）からの抗原反応性B細胞の解析と互換性があります。
その基本的な形式では、末梢血単核細胞を、最初に表現型分析のために必要な表面抗原、細胞に対する抗体と一緒にビオチン化抗原と共にインキュベートします。この標識工程は、洗浄及び固定に続いて、ストレプトアビジンを添加する（ 図1）ビオチン化抗原結合細胞の検出のための遠赤色蛍光色素に結合されています。以前の研究は同様に、抗原特異的B細胞を同定したが、直接蛍光色素8、9、10、11に結合させた抗原を用いています。これは価値があるが、アプローチは、ストレプトアビジンと組み合わせたビオチン化抗原の使用は、抗原は12、13、14小さい場合は特に、大きな信号増幅（結合および非結合細胞の、したがってより良い差別化）を可能にします。追加の考慮事項は、ストレプトアビジンの代わりにストレプトアビジンが脱グリコシル化されているので、非特異的結合を減少させるの使用です。さらに、我々は、その光安定、量子収率（明るさ）、およびその小さなサイズ（〜1.3キロダルトン）に蛍光色素として遠赤蛍光染料を使用しています。彼らは潜在的に多くの抗原性エピトープを含んでいるので、このようなフィコエリトリン（〜250キロダルトン）およびアロフィコシアニン（〜105 kD）の15のようなタンパク質の蛍光色素は最適ではありません。このような遠赤色蛍光色素として、単一のエピトープからなる小有機蛍光色素の使用は、単離された細胞集団の複雑性を低減します。
細胞がされるとビオチン化-Antigenと遠赤蛍光色素 – ストレプトアビジン吸着は、それらが抗遠赤蛍光色素結合磁性ナノ粒子を使用して濃縮されています。シングルナノ粒子は、ほとんどのフローサイトメーターによって検出されていないため、FACSソーティングと下流のアッセイ16による精製の前に除去する必要はありません。抗原特異的なB細胞のための磁気選択、フローサイトメーターを使用して稀なイベントを選別する時間とコストを排除する、関心の集団を濃縮します。
我々は前と7日破傷風トキソイドの追加免疫後に被験者からの破傷風トキソイド特異的B細胞の濃縮から代表的な結果を示し、以下に。我々は、in vivo刺激における急性以下の抗原特異的B細胞を濃縮するために、この方法の能力を実証するために、一例として、この特定のアプリケーションを選択しました。フローサイトメトリーと組み合わせると、この方法は、抗原特異的ナイーブ、メモリを濃縮し、分化することが可能であり、かつ形質B細胞および研究者が時間をかけて自分の周波数の変化に追従することができます。また、我々は、 例えば、細胞は、濃縮後の抗体を分泌する能力を保持することを実証するELISPOTアッセイ、別の可能な下流アッセイを含みます。この方法の別の用途は、宿主に濃縮された細胞の養子移入を伴う可能性があります。我々は以前に、細胞が単離および転送次抗原特異的T細胞を抗原提示細胞として作用する能力を維持示した（データ示さず）。したがって、一緒に抗原特異的免疫応答の理解を通知する方法、に結合することができる可能な下流アッセイの数があります。我々は全体の収率、純度、細胞特異性、および折り畳み式濃縮を決定するための制御を含む、以下の方法を、記載しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ヒト末梢血由来の抗原結合性B細胞の単離および濃縮を達成する新規な方法を記載します。この方法は、マウスに、そのような脾臓およびリンパ節など他の組織に容易に適用可能であり、細胞表現型および機能（原稿準備中）の後濃縮分析と互換性があります。
ユーザーは、この手順の成功に影響を与えることができる変数の数を認識すべきです。経験から死?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
References
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