L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari
Summary
In questo lavoro, segnaliamo un nuovo metodo per studiare le interazioni proteina-proteina usando un biosensore conduttimetriche basato sulla tecnologia ibrida β-lattamasi. Questo metodo si basa sul rilascio di protoni all’idrolisi di β-lattami.
Abstract
Biosensori stanno diventando sempre più importante e implementata in vari campi quali rilevamento del patogeno, diagnosi molecolare, monitoraggio ambientale e controllo della sicurezza alimentare. In questo contesto, abbiamo usato il β-lattamasi come enzimi reporter efficiente in diversi studi di interazione proteina-proteina. Loro capacità di accettare gli inserimenti di peptidi o proteine/domini strutturati fortemente incoraggia inoltre l’uso di questi enzimi per generare proteine chimeriche. In uno studio recente, abbiamo inserito un frammento di anticorpo di singolo dominio il Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Questi piccoli domini, chiamati anche nanobodies, sono definiti come i domini di antigene-leganti degli anticorpi di singola catena da camelidi. Come comune doppia catena anticorpi, essi mostrano elevata affinità e specificità per i loro obiettivi. La proteina chimerica risultante ha esibito un’alta affinità contro il bersaglio mantenendo l’attività β-lattamasi. Ciò suggerisce che le moiety nanobody e β-lactamase rimangono funzionali. Nel lavoro attuale, segnaliamo un protocollo dettagliato che combina il nostro sistema di β-lactamase ibrido per la tecnologia dei biosensori. Il grippaggio specifico di nanobody al suo target può essere rilevato grazie a una misurazione conduttimetriche dei protoni rilasciato dall’attività catalitica dell’enzima.
Introduction
Biosensori sono dispositivi analitici che combinano un’interazione bio-molecolari con dispositivi di segnalazione fisiche o chimiche denominate trasduttori1. Segnali registrati possono quindi essere interpretati e convertiti per monitorare le interazioni tra i partner immobilizzati e gratuiti. La maggior parte dei biosensori implicano l’uso di un anticorpo per rilevare analiti come ormoni o agente patogeno differente marcatori2. Formati di sensore diverso possono essere utilizzati e includono biosensori basati su massa, magnetici, ottici o elettrochimici. Quest’ultimo è tra i più comuni sensori utilizzati e funzione di conversione di un evento di associazione in un segnale elettrico. Le prestazioni e la sensibilità di tutti i biosensori basati su anticorpi sono fortemente dipendenti essenzialmente due parametri: i) la qualità dell’anticorpo e ii) le proprietà del sistema utilizzato per generare il segnale2.
Gli anticorpi sono proteine dimeriche massa molecolarità (150 – 160 kDa) che sono composte da due catene pesanti e due catene leggere. L’interazione tra le catene leggere e pesanti per la maggior parte è stabilizzata da interazioni idrofobiche, come pure un legame disolfuro conservato. Ogni catena include un dominio variabile che interagisce con l’antigene essenzialmente tramite tre regioni ipervariabili denominato complementari determinare regioni (CDR1-2-3). Nonostante i numerosi progressi nel settore, l’espressione su larga scala di anticorpi full-length con sistemi di espressione di basso costo (ad es., Escherichia coli) spesso porta alla produzione di proteine instabili e aggregate. Ecco perché vari frammenti di anticorpo sono stati progettati come catena singola variabile frammenti3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Sono costituiti da domini variabili di rispettivamente uno pesante e uno catene leggere che sono legati covalentemente da una sequenza di amminoacido sintetico. Tuttavia, questi frammenti spesso visualizzare una scarsa stabilità e hanno la tendenza ad aggregare, poiché espongono una grande parte delle loro regioni idrofobiche a solvente4. In questo contesto, frammenti di anticorpo camelide singola catena, indicati come nanobodies o VOX, sembrano essere ottime alternative a ScFvs. Questi domini corrispondono ai domini variabili degli anticorpi di camelide catena singola. In contrasto con gli anticorpi convenzionali, camelide anticorpi sono privi di catene chiare e contengono solo due catene pesanti5. Pertanto, nanobodies sono i frammenti di anticorpo monomerico più piccoli (12 kDa) in grado di legarsi a un antigene con un’affinità simile a quella di anticorpi convenzionali6. Inoltre, presentano una maggiore stabilità e solubilità rispetto ad altri anticorpi Full-Length o frammenti di anticorpo. Infine, le piccole dimensioni e loro estesi cicli CDR3 permettono loro di riconoscono epitopi criptici e si legano a siti attivi dell’enzima7,8. Al giorno d’oggi, questi domini stanno ricevendo una notevole attenzione e sono stati combinati per la tecnologia dei biosensori. Ad esempio, Huang et al. hanno sviluppato un biosensore basato su nanobody per la rilevazione e la quantificazione di umano antigene prostatico specifico (PSA)9.
Come sopra accennato, un parametro importante nelle analisi di biosensore è l’efficienza del sistema utilizzato per generare il segnale elettrico. Per questo motivo, biosensori elettrochimici basati su enzima hanno attirato l’attenzione crescente e sono stati ampiamente utilizzati per varie applicazioni quali sanità, sicurezza alimentare e monitoraggio ambientale. Questi biosensori affidano l’idrolisi catalitica di un substrato di un enzima per generare il segnale elettrico. In questo contesto, β-lattamasi sono stati indicati per essere più specifici, più sensibile e più facile da implementare sperimentalmente rispetto a molti altri enzimi come la fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano10. Β-lattamasi sono enzimi che sono responsabili della resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici idrolizzando li. Sono monomerici, molto stabile, efficiente e di piccole dimensioni. Inoltre, gli inserimenti di dominio/peptide in β-lattamasi generano proteine chimeriche bi-funzionali che sono state indicate per essere strumenti efficaci per studiare le interazioni proteina-ligando. Infatti, recenti studi hanno dimostrato che inserimento di variabile frammenti anticorpali nei risultati del β-lactamase TEM1 in una proteina chimerica che rimane in grado di legarsi con alta affinità per l’antigene bersaglio. È interessante notare che, l’associazione dell’antigene è stato indicato per indurre la regolazione allosterica di TEM1 attività catalitica11,12. Inoltre, abbiamo dimostrato in diversi studi che l’inserzione di dominio della proteina in un ciclo permissivo del Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genera proteine chimeriche funzionali che ben si adattano per monitorare le interazioni proteina-ligando13 ,14. Recentemente abbiamo inserito un nanobody, denominato cAb-Lys3, in questo sito di inserimento permissiva di BlaP15. Questo nanobody è stato indicato da associare alla gallina albume lisozima (HEWL) e di inibire la sua attività enzimatica16. Abbiamo mostrato che la proteina ibrida generato, denominata BlaP-cabina-Lys3, mantenuto un’alta specificità / affinità contro HEWL mentre l’attività β-lactamase è rimasto invariato. Poi con successo abbiamo combinato la tecnologia di β-lactamase ibrida di un biosensore elettrochimico e ha mostrato che la quantità di segnale elettrico generato era dipendente dell’interazione tra BlaP-cabina-Lys3 e HEWL immobilizzati su un elettrodo. Infatti, l’idrolisi degli antibiotici β-lattamici BlaP induce un rilascio di protoni che può essere convertito in un segnale elettrico quantitativo. Questa combinazione della tecnologia ibrida β-lactamase con un biosensore elettrochimico è veloce, sensibile e quantitativa e permette di misurare in tempo reale il segnale generato. Questa metodologia è descritto qui.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo lavoro presentiamo un metodo per funzionalizzare un nanobody utilizzando il β-lactamase BlaP come una proteina carrier e mostriamo che possiamo implementare con successo la proteina ibrida risultante in un’analisi di sensore potenziometrico. L’aspetto di innovazione principale del nostro lavoro rispetto ad altri dosaggi di biosensore è l’accoppiamento covalente della parte dell’anticorpo per l’attività enzimatica che genera il segnale elettrico. Questa tecnologia di inserimento della cosiddetta proteina pres…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono la regione vallona del Belgio, nel quadro dei progetti di ricerca SENSOTEM e NANOTIC nonché la nazionale fondi per la ricerca scientifica (f.r.s.-F.N.R.S) per il loro sostegno finanziario.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
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