Использование анализа на основе β-лактамаз Conductimetric биосенсора для обнаружения биомолекулярного взаимодействия
Summary
В этой работе мы приводим новый метод для изучения взаимодействия протеин протеина, с помощью conductimetric биосенсор на основе гибридной технологии β-лактамаз. Этот метод полагается на выпуск протонов после гидролиза β-лактамы.
Abstract
Биодатчики становятся все более важным и реализованных в различных областях, таких как обнаружение возбудителя, молекулярной диагностики, мониторинга окружающей среды и продовольственной безопасности управления. В этом контексте мы использовали β-лактамаз как эффективный репортер ферментов в нескольких исследованиях взаимодействия протеин протеина. Кроме того их способность принимать вставки пептидов или структурированные белки/домены решительно поощряет использование этих ферментов для создания химерных белков. В недавнем исследовании мы вставлен фрагмент одного домена антитела в Bacillus licheniformis я β-лактамаз. Эти небольшие доменов, также называемые nanobodies, определяются как антиген связывая доменов одной цепи антител от верблюдовых. Как общие антитела двойной цепи они показывают, высокой работоспособностью и специфики для их целей. Результате химерных белка выставлены высоким сродством против цели при сохранении активности β-лактамаз. Это свидетельствует о том, что наночастицы и β-лактамаз постановление остаются функциональными. В настоящей работе мы доклад подробный протокол, который сочетает в себе наш гибридной системы β-лактамаз биосенсор технологии. Конкретные привязки наночастицы своей цели могут быть обнаружены благодаря conductimetric измерение протонов, выпущенное каталитической активности фермента.
Introduction
Биодатчики, аналитических приборов, которые сочетают био молекулярная взаимодействия с физическими или химическими сигнализаторы, именуемый преобразователи1. Записанные сигналы можно затем интерпретировать и преобразованы в контролировать взаимодействие между партнерами, подвижности и бесплатные. Большинство биодатчиков используют антитела для обнаружения аналитов, например гормоны или маркеры различных патогена2. Датчик различные форматы могут быть использованы и включают на основе массы, магнитных, оптических или электрохимические биодатчиков. Последние относятся к числу наиболее часто используемых датчиков и функции путем преобразования привязки событий в электрический сигнал. Выступления и чувства всех биосенсоры на основе антител сильно зависит по сути два параметра: i) качество антитела и ii) свойства системы, используется для генерации сигнала2.
Антитела являются высокой молекулярной массы димерной белки (150 – 160 кДа), которые состоят из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. Взаимодействие между легкими и тяжелыми цепями основном стабилизирована гидрофобных взаимодействий, а также сохранены дисульфидными облигаций. Каждая цепь включает переменной домен, взаимодействующий с антигеном по существу через три гипервариабельных регионов, названный взаимодополняющих определения регионов (CDR1-2-3). Несмотря на многочисленные достижения в этой области, крупномасштабные выражение полнометражного антител с лоу кост выражение системами (например, кишечной палочки) часто приводит к производству нестабильных и агрегированных белков. Именно поэтому различные фрагменты антител разработаны такие как сингл цепь переменной фрагменты3 (ScFvs ≈ 25 кДа). Они состоят из переменной доменов соответственно один из тяжелых и один легкие цепи, которые связаны ковалентно синтетических аминокислотной последовательности. Однако эти фрагменты часто отображения бедных стабильности и имеют тенденцию к совокупности, поскольку они предоставляют большую часть их гидрофобные регионах растворителя4. В этом контексте одной цепи верблюдовые фрагментов антитела, называют nanobodies или VHHs, похоже отличные альтернативы ScFvs. Эти домены соответствуют переменной домены верблюдовые сингл цепь антител. В отличие от обычных антитела антитела верблюдовые лишены легких цепей и содержать только две тяжелые цепи5. Таким образом nanobodies являются наименьшей мономерных антитела фрагменты (12 кДа) способны связывать к антигену с сродство похож на обычного антитела6. Кроме того они представляют, улучшена стабильность и растворимость, по сравнению с другими полнометражного антител или фрагментов антитела. Наконец их малых размеров и их расширенные петли CDR3 позволяют им признать загадочные эпитопов и привязка к фермента активных сайтов7,8. В настоящее время эти домены получают значительное внимание и были объединены в биосенсор технологии. Например, Хуан и др. разработали на основе наночастицы биосенсора для обнаружения и количественного определения человека простат специфический антиген (PSA)9.
Как упоминалось выше важным параметром в анализов биодатчик является эффективность системы, используемая для создания электрического сигнала. По этой причине на основе ферментов электрохимических биодатчики привлекают все большее внимание и широко используются для различных приложений таких, как здравоохранение, продовольственная безопасность и мониторинг окружающей среды. Эти биодатчики полагаются на каталитического гидролиза субстрата ферментом для генерации электрического сигнала. В этом контексте чтобы быть более конкретным, более чувствительную и легче реализовать, чем многие другие ферменты, такие как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена10экспериментально были показаны β-лактамаз. Β-лактамаз являются ферменты, которые отвечают за бактериальной резистентности к β-лактамные антибиотики, ГТФ их. Они являются мономерных, очень стабильных, эффективных и небольших размеров. Кроме того домен/пептид вставок в β-лактамаз генерировать Би функциональные химерных белки, которые оказались эффективными инструментами для изучения взаимодействий протеин лиганд. Действительно недавние исследования показали что включение переменной фрагментов антитела в результаты β-лактамаз ТЭМ1 в химерных белок, который по-прежнему способны связывать с высоким сродством к своей целевой антигена. Интересно, что было показано антиген-связывая побудить аллостерический регулирование ТЭМ1 каталитической активности11,12. Кроме того мы показали в нескольких исследованиях вставки домен белка в разрешительной петлю Bacillus licheniformis я β-лактамаз создает функциональные химерных белки, которые хорошо подходят для отслеживания взаимодействий протеин лиганд13 ,14. Мы недавно вставлены наночастицы, названный кабины Lys3, в этом разрешительной вставки сайт я15. Этот наночастицы было показано для привязки к курица яичного белка лизоцима (HEWL) и подавлять свою ферментативную активность16. Мы показали, что созданные гибридный белок, именем я такси Lys3, сохраняется высокая специфичность / сродство против HEWL в то время как активность β-лактамаз оставалась без изменений. Затем мы успешно объединены β-лактамаз гибридные технологии электрохимический биодатчик и показал, что количество создаваемых электрического сигнала зависит от взаимодействия между я такси Lys3 и HEWL, иммобилизованных на электрод. Действительно гидролиз β-лактамные антибиотики, я индуцирует Протон выпуска, который может быть преобразован в количественных Электрический сигнал. Эта комбинация гибридной технологии β-лактамаз с электрохимический биодатчик быстро, чувствительных, количественных и позволяет в реальном времени измерения генерируемого сигнала. Эта методология описана здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы представляем метод functionalize наночастицы, используя я β-лактамаз как перевозчика белка и мы показываем, что мы можем успешно реализовать полученный гибридного белка в assay потенциометрических датчиков. Главное нововведение аспект нашей работы, по сравнению с другими биос?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, Валлонский регион Бельгия в рамках исследовательских проектов SENSOTEM и NANOTIC, а также национальные фонды для научных исследований (Ричмонд-F.N.R.S) за их финансовую поддержку.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O’Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D’Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- . . Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).
