Brug af en β-lactamase-baseret Conductimetric Biosensor Assay til påvisning Biomolekylær interaktioner
Summary
I dette arbejde rapportere vi en ny metode til at undersøge protein-protein interaktioner ved hjælp af en conductimetric biosensor baseret på β-lactamase Hybridteknologien. Denne metode bygger på frigivelse af protoner ved hydrolyse af β-lactamer.
Abstract
Biosensorer bliver stadig vigtigere og mere gennemført i forskellige felter som patogen detektion, Molekylær diagnose, miljøovervågning og mad sikkerhed kontrol. I denne sammenhæng brugte vi β-lactamaser som effektiv reporter enzymer i flere protein-protein interaktion undersøgelser. Derudover opfordrer deres evne til at acceptere indsætninger af peptider eller struktureret proteiner/domæner kraftigt til brug af disse enzymer til at generere kimære proteiner. I en nylig undersøgelse indsat vi et enkelt domæne antistof fragment i Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Disse små domæner, også kaldet nanobodies, er defineret som de antigen-bindende domæner af enkelt kæde antistoffer fra camelids. Som fælles dobbelt kæde antistoffer viser de høje tilhørsforhold og særlige forhold til deres mål. Den resulterende kimære protein udstillet en høj affinitet mod sit mål samtidig bevare β-lactamase aktivitet. Dette tyder på, at nanobody og β-lactamase fraspaltning forbliver funktionel. I det foreliggende arbejde rapporterer vi en detaljeret protokol, der kombinerer vores hybrid β-lactamase system til biosensor teknologi. Specifikke bindingen af nanobody til sit mål kan blive opdaget takket være en conductimetric måling af protoner frigivet ved den katalytiske aktivitet af enzymet.
Introduction
Biosensorer er analytiske enheder, der kombinerer en bio-Molekylær interaktion med fysiske eller kemiske signaling enheder kaldes transducere1. Optaget-signaler kan derefter fortolkes og konverteres til at overvåge interaktioner mellem immobiliserede og gratis partnere. De fleste af biosensorer indebærer brug af et antistof til at opdage analysander såsom hormoner eller forskellige patogen markører2. Forskellige sensor-formater kan bruges og omfatter masse-baseret, magnetisk, optisk eller elektrokemiske biosensorer. Sidstnævnte er blandt de mest almindeligt anvendte sensorer, og fungerer ved at konvertere en bindende begivenhed til et elektrisk signal. Forestillinger og følsomhed af alle antistof-baserede biosensorer er stærkt afhængige af hovedsagelig to parametre: i) kvaliteten af antistoffet og ii) systemet bruges til at generere signal2egenskaber.
Antistoffer er høj-molekylære masse dimerisk proteiner (150-160 kDa), der består af to tunge kæder og to lys kæder. Samspillet mellem de lette og tunge kæder er for det meste stabiliseret med hydrofobe interaktioner samt en bevaret disulfid obligation. Hver kæde omfatter en variabel domæne, der interagerer med antigen hovedsagelig via tre hypervariable regioner opkaldt supplerende bestemmelse af regioner (CDR1-2-3). Trods mange fremskridt inden for feltet, de storstilede udtryk for fuld længde antistoffer med low-cost udtrykket systemer (fx E. coli) ofte fører til produktion af ustabile og aggregerede proteiner. Det er derfor forskellige antistof fragmenter er blevet udviklet som single-kæde variabel fragmenter3 (ScFvs ≈ 25 kDa). De består af de variable domæner i henholdsvis en tung og en lys kæder, der er kovalent forbundet af en syntetisk aminosyresekvens. Men disse fragmenter ofte vise en dårlig stabilitet og har tendens til at sammenlægge, eftersom de udsætter en stor del af deres hydrofobe regioner til solvent4. I denne forbindelse synes enkelt kæde camelid antistof fragmenter, kaldet nanobodies eller VHHs, at være gode alternativer til ScFvs. Disse domæner svarer til de variable domæner i camelid single-kæde antistoffer. I modsætning til konventionelle antistoffer, camelid antistoffer er blottet for lys kæder og kun indeholde to tunge kæder5. Derfor, nanobodies er de mindste monomere antistof fragmenter (12 kDa) stand til at binde sig til antigen, en affinitet svarer til konventionelle antistoffer6. Derudover nuværende de forbedret stabilitet og Opløselighed i forhold til andre fuld længde antistoffer eller antistof fragmenter. Endelig, deres små størrelser og deres udvidede CDR3 sløjfer tillade dem at genkende kryptiske epitoper og binde til enzymet aktive steder7,8. I dag er disse domæner får stor opmærksomhed og har været kombineret til biosensor teknologi. For eksempel, Huang mfl. har udviklet en nanobody-baseret biosensor for påvisningen og kvantificeringen af humane prostata-specifikt antigen (PSA)9.
Som nævnt-ovenfor er en vigtig parameter i biosensor assays effektiviteten af systemet bruges til at generere det elektriske signal. Af denne grund, enzym-baserede elektrokemiske biosensorer har tiltrukket stadig større opmærksomhed og har været udbredt til forskellige applikationer såsom sundhedspleje, fødevaresikkerhed og miljøovervågning. Disse biosensorer stole på katalytiske hydrolyse af et underlag af et enzym til at generere det elektriske signal. I denne sammenhæng viste β-lactamaser sig at være mere specifik, mere følsomme og lettere at gennemføre eksperimentelt end mange andre enzymer såsom basisk fosfatase eller peberrodsperoxidase10. Β-lactamaser er enzymer, der er ansvarlig for bakteriel resistens over for β-lactam antibiotika af hydrolyzing dem. De er monomere, meget stabile, effektive, og af ringe størrelse. Derudover generere domæne/peptid indsættelser i β-lactamaser bi-funktionelle kimære proteiner, der viste sig at være effektive redskaber til at undersøge protein-ligand interaktioner. Ja, nyere undersøgelser har vist at indsættelse af antistof variable fragmenter i TEM1 β-lactamase resultater i en kimære protein, der fortsat er stand til at binde med høj affinitet til dens mål antigen. Interessant, blev antigen-bindende vist sig at fremkalde allosteriske regulering af TEM1 katalytiske aktivitet11,12. Endvidere viste vi i flere undersøgelser at protein domæne indsættelse i en eftergivende loop af Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genererer funktionelle kimære proteiner, der er velegnet til at overvåge protein-ligand interaktioner13 ,14. Vi har for nylig indsat en nanobody, opkaldt cAb-Lys3, i denne eftergivende indsættelsesstedet BlaP15. Denne nanobody blev vist til at binde til høne-æggehvide lysozym (HEWL) og til at hæmme dets enzymatiske aktivitet16. Vi viste at det genererede hybrid protein, opkaldt BlaP-cAb-Lys3, bevaret en høj specificitet / affinitet mod HEWL mens β-lactamase aktivitet forblev uændret. Så vi med held kombinerede bastard β-lactamase teknologi til en elektrokemisk biosensor og viste, at mængden af genererede elektrisk signal var afhængig af samspillet mellem BlaP-cAb-Lys3 og HEWL immobiliseret på en elektrode. Faktisk, hydrolyse af β-lactam antibiotika ved BlaP inducerer en proton udgivelse, der kan omdannes til en kvantitativ elektrisk signal. Denne kombination af β-lactamase Hybridteknologien med en elektrokemisk biosensor er hurtig, følsomme, kvantitative, og giver mulighed for real-time måling af den genererede signal. Denne metode er beskrevet heri.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde præsenterer vi en metode til at functionalize en nanobody ved hjælp af BlaP β-lactamase som en transportør protein og vi viser, at vi med succes kan gennemføre de resulterende hybrid protein i en potentiometrisk sensor assay. Den vigtigste nyskabelse aspekt af vores arbejde i forhold til andre biosensor assays er den kovalente kobling af antistof del til den enzymatiske aktivitet, der genererer det elektriske signal. Denne såkaldte protein indsættelse teknologi præsenterer fordele og begrænsninge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender det vallonske Region i Belgien inden for rammerne af forskningsprojekterne, SENSOTEM og NANOTIC samt den nationale midler For den videnskabelige forskning (F.R.S.-F.N.R.S) for deres finansielle støtte.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O’Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D’Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- . . Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).
