生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用
Summary
この作品は、ハイブリッドの β-ラクタマーゼ技術に基づく伝導度センサーを用いたタンパク質間相互作用を研究する手法を報告する.このメソッドは、β-ラクタムの加水分解時に陽子のリリースに依存しています。
Abstract
バイオ センサーは、病原体検出、分子診断、環境監視、および食品安全性の管理などさまざまな分野でますます重要かつ実装になっています。この文脈では、いくつかのタンパク質間相互作用研究の効率的なレポーター酵素と β-ラクタマーゼを使用しました。さらに、強くペプチッドまたは構造化蛋白質/ドメインの挿入を受け入れる能力はキメラ蛋白質を生成するこれらの酵素の使用を奨励しています。最近の研究ではバチルス リチェニホルミスブッ β-ラクタマーゼに単一ドメイン抗体フラグメントを挿入されます。Nanobodies とも呼ばれるこれらの小さなドメインは、ラクダから一本鎖抗体の抗原結合ドメインとして定義されます。共通の二重鎖抗体のよう彼らは高い親和性と特異性の目標を表示します。結果のキメラ蛋白質 β-ラクタマーゼの活性を維持しながらその目標に対して高い親和性を展示しました。機能生物学: ナノボディで、β-ラクタマーゼの鎖を維持することが示唆されました。現在の仕事では、バイオ センサー技術に当社のハイブリッド β-ラクタマーゼのシステムを組み合わせた詳細なプロトコルを報告します。生物学: ナノボディでターゲットの特定の結合は、酵素の触媒活性が発表したプロトンの伝導度測定のおかげで検出できます。
Introduction
バイオ センサー、トランスデューサー1と呼ばれる物理または化学のシグナリング デバイスと生体分子の相互作用を結合した分析機器です。記録された信号の解釈および固定化と無料のパートナー間の相互作用を監視に変換できます。グルコのほとんどは、ホルモンなど異なる病原体マーカー2検体を検出する抗体の使用を含みます。別のセンサー フォーマットは使用でき、質量ベース、磁気、光学または電気化学バイオ センサーが含まれます。後者は最も一般に使用されるセンサーとバインディング イベントを電気信号に変換することによって機能します。公演とすべて抗体を用いたバイオ センサーの感度は、本質的に 2 つのパラメーターに強く依存する: i) 抗体と ii)2の信号を生成するために使用するシステムのプロパティの品質。
抗体は 2 つの重鎖および 2 つの軽鎖から成る高分子質量二量体蛋白質 (150-160 kDa) です。光と重鎖間の相互作用を主に保存されたジスルフィド結合と同様に、疎水性相互作用によって安定させます。各チェインには、本質的に補完決定領域 (CDR1-2-3) という 3 つの超可変領域を介して抗原と相互作用変数の領域が含まれています。フィールド、大規模な低コスト式システム (例えば、エシェリヒア属大腸菌) とフルレングス抗体発現の多数の進歩にもかかわらず、しばしば不安定で集約された蛋白質の生産に 。だからこそ、さまざまな抗体フラグメント、単一鎖変数3 (ScFvs ≈ 25 kDa) の断片のように設計されてです。彼らは、それぞれ 1 つの重いと共有結合合成アミノ酸シーケンスによってリンクされている 1 つの軽鎖の可変領域で構成されます。ただし、これらのフラグメントはしばしば安定性の悪いを表示され、集計、溶剤4その疎水性領域の大きい部分を公開するために傾向があります。この中で、nanobodies または VHHs と呼ばれる、単一のチェーン ラクダ科動物抗体フラグメントは ScFvs に優れた選択肢と思われます。これらのドメインは、ラクダ科一本鎖抗体の可変領域に対応します。従来の抗体と対照をなしてラクダ科動物抗体軽鎖を欠いている、のみ 2 つの重鎖5が含まれます。したがって、nanobodies は、従来の抗体6のような親和性を持つ抗原に結合することができる最小単量体抗体フラグメント (12 kDa)。さらに、安定性の向上と他のフルレングスの抗体や抗体フラグメントと比較して溶解性を呈する。最後に、その小さなサイズと、拡張 CDR3 ループに、不可解なエピトープを認識し、酵素活性部位7、8にバインドする許可にします。今日では、これらのドメインはかなりの注目を受けているし、バイオ センサー技術に結合されています。たとえば、黄ら。検出と人間の前立腺特異抗原 (PSA)9の定量化のための生物学: ナノボディでベースのバイオ センサーを開発しました。
言及した上としてバイオ センサーの試金で重要なパラメーターは電気信号を生成するために使用するシステムの効率です。このため、酵素法による電気化学バイオ センサーはますます注目を集めている、健康管理、食品の安全性や環境モニタリングなど様々 な用途に広く使用されています。これらのバイオ センサーは、電気信号を生成する酵素による基質の触媒加水分解に依存します。この文脈では、β-ラクタマーゼより具体的より敏感とアルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ10など多くの他の酵素よりも実験的に実装する方が簡単に示されていた。Β-ラクタマーゼは β-ラクタム系抗生物質に耐性菌の責任、それらを加水分解する酵素です。彼らは、単量体、非常に安定した、効率的、かつ小さなサイズが。さらに、β-ラクタマーゼ挿入ドメイン/ペプチドはタンパク質-リガンド相互作用を研究する効率的なツールであることが示された bi 機能のキメラ蛋白質を生成します。確かに、最近の研究はその標的抗原に高い親和性と結合することができるままキメラ蛋白質 TEM1 β-ラクタマーゼ結果に変数の抗体のフラグメントをその挿入を示しています。興味深いことに、抗原結合 TEM1 触媒活性11,12のアロステリック効果を誘導するために示されました。さらに、我々 はバチルス リチェニホルミスブッ β-ラクタマーゼの寛容なループにタンパク質ドメイン挿入が蛋白質-リガンド相互作用13 を監視に適しています機能のキメラ蛋白質を生成するいくつかの研究で示した ,14。生物学: ナノボディで、ブッ15のこの寛容な挿入部位にという名前の cAb Lys3、最近挿入した.この生物学: ナノボディで示した鶏卵白リゾチーム (リゾチーム) にバインドする16その酵素活性を阻害します。ブッ-タクシー-Lys3 の名前生成されたハイブリッド蛋白質は高い特異性を保持/親和性リゾチーム β-ラクタマーゼ活性のまま変更しないことを示した.そして我々 は正常に β-ラクタマーゼ技術のハイブリッド電気化学バイオ センサーを組み合わせるし、生成された電気信号の量がブッ cAb Lys3 と電極に固定化したリゾチームの相互作用に依存していたことを示した。確かに、ブッによる β-ラクタム系抗生物質の加水分解は、定量的な電気信号に変換することができますプロトン放出を誘導します。このハイブリッド β-ラクタマーゼ技術電気化学バイオ センサーとの組み合わせは、高速、高感度、定量、生成された信号のリアルタイム測定が可能.この方法を次に記載します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この作品で生物学: ナノボディでキャリア蛋白質としてブッ β-ラクタマーゼを使用しての高機能化する手法を提案し、電位差センサー アッセイで、結果として得られるハイブリッド タンパク質を正常に実装できることを示します。他のバイオ センサーの試金と比較して我々 の仕事の主な技術革新の側面は、電気信号を生成する酵素活性の抗体部分の共有カップリングです。このいわゆるタ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、SENSOTEM と NANOTIC の研究プロジェクトの枠組みの中でベルギーのワロン地域だけでなく、国家資金の科学研究 (F.R.S.-F.N.R.S) 金融支援を認めます。
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
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