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Bioengineering

बाह्य मैट्रिक्स व्युत्पन्न foams और ऊतक विशेष सेल संस्कृति और प्रसव के प्लेटफार्म के रूप में Microcarriers का निर्माण

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55436
Automatic Translation
1, 2, 3, 2,4
1Biomedical Engineering Graduate Program, The University of Western Ontario, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, The University of Western Ontario, 3Department of Chemical Engineering, Queen's University, 4Department of Chemical & Biochemical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Western Ontario

Summary

ऊतक विशेष बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सेल समारोह की एक प्रमुख मध्यस्थ है। यह लेख शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers कि इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में उन्नत 3 डी में अनुप्रयोगों के लिए या समर्थक पुनर्योजी bioscaffolds के रूप में रासायनिक तिर्यक की आवश्यकता के बिना संस्कृति में स्थिर रहे हैं synthesizing के लिए तरीके का वर्णन है।

Abstract

सेल समारोह बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) है, जो जटिल ऊतक-विशिष्ट संरचना और वास्तुकला है के साथ बातचीत द्वारा मध्यस्थता है। इस लेख का ध्यान केंद्रित विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में या ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए समर्थक पुनर्योजी scaffolds और सेल वितरण प्रणाली के रूप में उन्नत 3 डी में जैविक रूप से प्रासंगिक substrates के रूप में उपयोग के लिए ईसीएम व्युत्पन्न झरझरा फोम और microcarriers fabricating के लिए तरीकों पर है। एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में decellularized ऊतकों या शुद्ध अघुलनशील कोलेजन का उपयोग करना, तकनीक अनुकूलन geometries के साथ ऊतक विशेष bioscaffolds की एक व्यापक श्रेणी के संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता। दृष्टिकोण यांत्रिक प्रसंस्करण और एक ईसीएम निलंबन है कि नियंत्रित ठंड और lyophilization प्रक्रियाओं के माध्यम से तीन आयामी फोम या microcarriers निर्माण किया जाता है उपज के लिए हल्के एंजाइमी पाचन शामिल है। ये शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न scaffolds अत्यधिक झरझरा, फिर भी रासायनिक की आवश्यकता के बिना स्थिर रहे हैंअल एजेंट या अन्य additives कि नकारात्मक कोशिकाओं के कार्य को प्रभावित कर सकता crosslinking। पाड़ गुण ऐसे ईसीएम निलंबन एकाग्रता, यांत्रिक प्रसंस्करण विधियों, या संश्लेषण की स्थिति के रूप में अलग-अलग कारकों से कुछ हद तक नियोजित किया जा सकता। सामान्य तौर पर, मचान मजबूत और संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, और सबसे मानक जैविक assays के लिए ऊतकों के रूप में संसाधित किया जा सकता, कि देशी ईसीएम रचना की नकल करता एक बहुमुखी और उपयोगकर्ता के अनुकूल 3 डी सेल संस्कृति मंच प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, अनुकूलित ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers fabricating के लिए इन सरल तरीकों दोनों जीव और इन विट्रो के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों में ऊतक विशेष सेल शिक्षाप्रद प्लेटफॉर्म के रूप में जैव चिकित्सा इंजीनियरों के हित के लिए हो सकता है।

Introduction

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन, ग्लाइकोप्रोटीन, और पॉलीसैकराइड 1 की एक जटिल 3 डी नेटवर्क के शामिल है। एक बार एक मुख्य रूप से संरचनात्मक ढांचे के रूप में माना, अब यह अच्छी तरह से स्वीकार किया कि ईसीएम महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिकाओं 2 के साथ जैवसक्रिय अणुओं की एक विविध सरणी को शामिल किया गया है। सेल ईसीएम बातचीत सेल अस्तित्व, आसंजन, प्रवास, प्रसार, और भेदभाव 3 प्रत्यक्ष कर सकते हैं। ईसीएम बड़े अणुओं के प्रमुख वर्गों आम तौर पर अच्छी तरह से ऊतकों और प्रजातियों के संरक्षण कर रहे हैं, प्रत्येक ऊतक एक अनूठा मैट्रिक्स संरचना और वास्तुकला 4 है। कुल मिलाकर, ऊतक विशेष ईसीएम एक शिक्षाप्रद सूक्ष्म पर्यावरण ऊतक / अंग पैमाने से 5 subcellular से समारोह मध्यस्थता करता है कि प्रदान करता है।

सेलुलर समारोह में मध्यस्थता करने में ईसीएम के महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, डी में रुचि बढ़ रही हैऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा में अनुप्रयोगों के लिए ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffolds की velopment। विशेष रूप से, decellularization की विधि बड़े पैमाने पर ऊतक पुनर्जनन और सेल वितरण 5, 6, 7 के लिए एक मचान सामग्री के रूप में उपयोग के लिए ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला से ईसीएम प्राप्त करने के साधन के रूप का पता लगाया गया है। Decellularization आम तौर पर, जबकि आदर्श 3 डी संरचना और ईसीएम 8 की रचना करने के लिए कम से कम परिवर्तन के कारण यांत्रिक, रासायनिक, और / या जैविक उपचार चरणों कोशिकाओं और सेलुलर घटकों को दूर करने पर लक्षित की एक श्रृंखला शामिल है,। साहित्य सर्वेक्षण के माध्यम से, विभिन्न decellularization प्रोटोकॉल शरीर 7 में लगभग हर ऊतक के लिए पहचाना जा सकता है।

decellularized ऊतकों प्रत्यारोपण scaffolds या 3 डी सेल संस्कृति substrates के रूप में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, सेलुलर घुसपैठ कर सकते हैंएक घने ईसीएम संरचना 9 के साथ ऊतकों में सीमित हो। इसके अलावा, ईसीएम में प्राकृतिक विविधता सेल लगाव और decellularized मैट्रिक्स, जो संभवतः सेलुलर प्रतिक्रिया 10 पर प्रभाव पड़ सकता भीतर वितरण में परिवर्तनशीलता हो सकती है। कुल मिलाकर, जबकि कुछ अनुप्रयोगों के लिए वादा किया है, उनके बरकरार रूप में decellularized ऊतकों को लागू करने के आकार, सरंध्रता, और कठोरता सहित ट्यूनिंग पाड़ गुणों के संदर्भ में सीमित बहुमुखी प्रतिभा है, साथ ही इन विवो अनुप्रयोगों के लिए प्रसव के मोड प्रदान करता है।

इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, कई अनुसंधान समूहों एक आधार सामग्री के रूप decellularized ऊतकों का उपयोग कर अनुकूलित पाड़ स्वरूपों उत्पन्न करने के लिए आगे की प्रक्रिया के तरीकों को लागू करने कर रहे हैं। सरलतम रूप में, इस decellularized ऊतकों cryomilling इंजेक्शन ऊतक विशेष ईसीएम कणों 11 उत्पन्न करने के लिए शामिल हो सकता है। ये ईसीएम कणों को एक सेल वाद्य के रूप में शामिल किया जा सकताजैसे यथास्थान हाइड्रोजेल 12, 13, 14 crosslinking में के रूप में अन्य biomaterials के साथ संयुक्त मचान, में ctive घटक। यांत्रिक प्रसंस्करण के अलावा, decellularized ऊतकों भी 3 डी मुद्रण के लिए प्रोटियोलिटिक और / या ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों ईसीएम व्युत्पन्न हाइड्रोजेल, फोम microcarriers निर्माण करना, और कोटिंग्स 15, 16, 17 के साथ एंजाइमी पाचन, साथ ही के संश्लेषण के लिए bioinks के अधीन किया जा सकता है 18।

ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के अलावा, ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffolds जैविक अनुसंधान के लिए इन विट्रो मॉडल में उच्च विश्वस्तता की पीढ़ी के लिए काफी संभावना पकड़ो। एक महत्वपूर्ण 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली है कि बेहतर देशी सेलुलर सूक्ष्म पर्यावरण 19 पुनरावृत्ति को विकसित करने की जरूरत है। अधिकांश इन विट्रो गतारीख करने के लिए ell संस्कृति के अध्ययन टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) है, जो जैविक रूप से जटिल और गतिशील सेलुलर जीवित ऊतकों 20 के भीतर पाया परिवेश के साथ थोड़ा सहसंबंध है पर आयोजित की जाती हैं। जबकि सेलुलर बातचीत एक नियंत्रित वातावरण के भीतर इन सरलीकृत कठोर 2 डी substrates पर, कोशिकाओं का अध्ययन संवर्धन के लिए सुविधाजनक सेल लगाव और आकृति विज्ञान, साथ ही दोनों कोशिका कोशिका और कोशिका-ईसीएम बदल 21 बातचीत, 22। सेलुलर 2 डी TCPS को मनाया रूपांतरों intracellular संकेत दे रास्ते कि अस्तित्व, प्रसार, प्रवास, और भेदभाव सहित विविध सेल काम करता है, विवो प्रणालियों 23 में मॉडलिंग में 2 डी पढ़ाई की प्रासंगिकता के सवाल उठाये विनियमित प्रभावित कर सकता है। बढ़ता जा रहा मान्यता है कि सेलुलर व्यवहार बनाम 3 डी सिस्टम 24 2 डी में भिन्न हो सकते हैं, और कहा कि जैव रासायनिक और द्वि कर दिया गया हैईसीएम साथ omechanical संकेतन सेल समारोह 25 के प्रमुख मध्यस्थों हैं। कई समूह इस तरह के कोलेजन, laminin, और फाइब्रोनेक्टिन के रूप में ईसीएम घटकों के साथ TCPS कोटिंग द्वारा स्थापित 2 डी सिस्टम की सीमाओं को पार करने का प्रयास किया है। इन रणनीतियों सेल लगाव सुधार कर सकते हैं और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को बदल सकता है, इन मॉडलों उनके 2 डी विन्यास है कि जटिल स्थानिक संगठन या देशी ईसीएम 26, 27 के जैव रसायन की नकल नहीं करता है के द्वारा ही सीमित रहते हैं।

हमारे बायोइन्जिनियरिंग प्रयोगशाला 3 डी सेल संस्कृति और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए substrates के रूप में ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffolds के विकास में दिलचस्पी है। विशेष रूप से, हम वसा उत्थान 28 के लिए एक मंच के रूप में मचान (डीएटी) decellularized वसा ऊतकों के उपयोग का बीड़ा उठाया है। इसके अलावा, हम 3 डी microcarriers और झरझरा फोम डी का उपयोग कर synthesizing के लिए तरीकों की स्थापना की हैएटी प्रोटियोलिटिक एंजाइम पेप्सिन या ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम के साथ पचा α-amylase 29, 30, 31। विशेष रूप से, हम इन पाड़ प्रारूपों कि वसा व्युत्पन्न ईसीएम संस्कृति में मानव वसा व्युत्पन्न स्टेम / stromal कोशिकाओं (ASCs) की adipogenic भेदभाव के लिए एक आगमनात्मक सूक्ष्म पर्यावरण प्रदान करता है के सभी भर में प्रदर्शन किया है। हाल ही में, हम अपने निर्माण के तरीकों बढ़ाया decellularized बाएं वेंट्रिकल (dlv) α-amylase-पचा सुअर से 3 डी झरझरा फोम उत्पन्न करने के लिए (decellularization तरीकों वेनराइट एट अल से अनुकूलित। 32), और पता चला है कि वे जल्दी cardiomyogenic उत्प्रेरण के लिए एक सहायक मंच प्रदान मानव पेरिकार्डियल वसा व्युत्पन्न ASCs 31 में मार्कर अभिव्यक्ति।

इस लेख का विस्तार से वर्णन गैर रासायनिक तिर्यक 3D झरझरा फोम और microcarriers विशुद्ध रूप से ली गई synthesizing के लिए तरीकेसे इन विट्रो सेल संस्कृति substrates में जैविक रूप से जटिल 3 डी के रूप में उपयोग के लिए और ऊतक पुनर्जनन के लिए biomaterials के रूप में α-amylase-पचा ईसीएम। सिद्धांत रूप में, किसी भी ईसीएम उच्च आणविक भार कोलेजन युक्त स्रोत इन तकनीकों के लिए प्रारंभ माल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। , सुअर decellularized त्वचीय ऊतक (डीडीटी) 8, और प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में सुअर dlv इस दृष्टिकोण के लचीलेपन का प्रदर्शन करने के लिए, तरीकों मानव डैट का उपयोग कर ऊतक विशेष bioscaffolds उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है। चित्रा 1 ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers के लिए निर्माण की प्रक्रिया का एक दृश्य अवलोकन प्रदान करता है।

आकृति 1
चित्रा ऊतक विशेष ईसीएम व्युत्पन्न foams और Microcarriers के उत्पादन के लिए विधि की 1. अवलोकन। 1. decellularized ऊतकों, के बाद स्थापित तैयार decellularization प्रोटोकॉल, ऊतक विशेष ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffold निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्थूल छवियों 2010 32 हाइड्रेटेड मानव डैट के दिखाए जाते हैं, सुअर डीडीटी (फ्लिन 2010 28 में वर्णित के रूप में तैयार) (Reing, जेई, एट अल में वर्णित के रूप तैयार किया। 2010 8), और सुअर dlv (वेनराइट एट अल में वर्णित के रूप तैयार किया। ), ईसीएम सूत्रों के प्रतिनिधि उदाहरण है कि प्रारंभिक सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। स्केल सलाखों 3 सेमी प्रतिनिधित्व करते हैं। 2. decellularized ऊतकों lyophilized कर रहे हैं, और फिर 3. यंत्रवत् कीमा बनाया हुआ। स्केल सलाखों 1 सेमी प्रतिनिधित्व करते हैं। 4. कीमा बनाया हुआ ईसीएम तो cryomilled जा सकता है, जो फोम निर्माण के लिए वैकल्पिक है, लेकिन microcarrier संश्लेषण के लिए आवश्यक। स्केल बार 3 मिमी प्रतिनिधित्व करता है। 5. कीमा बनाया हुआ या cryomilled ईसीएम तो α-amylase साथ पचा और एक समरूप ईसीएम निलंबन बनाने के लिए homogenized है। स्केल बार 1 सेमी प्रतिनिधित्व करता है। 6b) microcarrier निर्माण के लिए, cryomilled ईसीएम निलंबन असतत गोलाकार microcarriers उत्पन्न करने के लिए electrosprayed है। स्केल बार 2 मिमी प्रतिनिधित्व करता है। 7. फोम और microcarriers फिर धीरे-धीरे rehydrated और कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। प्रतिनिधि छवियों (व्यवहार्य कोशिकाओं = हरा) मानव ASCs के लिए दिखाए जाते हैं एक डैट फोम (बाएं) और डैट microcarrier (दाएं) पर वरीयता प्राप्त। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

1. decellularized ऊतक प्रसंस्करण

  1. Decellularization और Lyophilization
    1. Decellularize हित के ऊतक (रों) एक स्थापित प्रोटोकॉल का पालन।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में Scaffolds मानव डैट 28, सुअर डीडीटी 8, और सुअर dlv 32 के लिए प्रकाशित decellularization प्रोटोकॉल निम्नलिखित तैयार किया गया है। 50 मिलीग्राम / एमएल - वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध, अघुलनशील कोलेजन भी इस तरह के गोजातीय कण्डरा, जो सफलतापूर्वक 10 की एकाग्रता सीमा पर इस्तेमाल किया गया है से प्राप्त कोलेजन के रूप में फोम और microcarriers, निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य अघुलनशील कोलेजन स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एकाग्रता रेंज है कि स्थिर scaffolds निकलेगा पहचान करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती।
    2. ऊतक डूब के लिए संदंश के साथ एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में हाइड्रेटेड decellularized ऊतक या शुद्ध कोलेजन स्थानांतरण और, पर्याप्त दोहरा आसुत जल (DDH 2 हे) जोड़ टी35 एमएल की oa अधिकतम कुल मात्रा।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूना फ्रीज, बाद में lyophilization दौरान उदात्तीकरण के लिए सतह क्षेत्र को अधिकतम करने के ठंड के दौरान क्षैतिज तैनात अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ।
    4. अपकेंद्रित्र ट्यूब से टोपी निकालें और एक lyophilization जार में जमे हुए नमूना हस्तांतरण।
    5. 72 घंटे या पूरी तरह से सूखे तक - 48 के लिए एक प्रयोगशाला फ्रीज ड्रायर का उपयोग कर नमूना Lyophilize।
      नोट: समय सुखाने अलग lyophilizers और decellularized ऊतकों के लिए भिन्न हो सकते हैं।
    6. (- 2 मिमी 3 ~ 1) तेज शल्य कैंची का उपयोग कर बारीक छोटे टुकड़ों में lyophilized ईसीएम कीमा।
    7. आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार है जब तक एक desiccator में कीमा बनाया हुआ ईसीएम संग्रहित करें।
      नोट: यह अनुशंसित है कि कीमा बनाया हुआ ईसीएम तुरंत इस्तेमाल किया जा वातावरण से नमी अवशोषण को रोकने के लिए।
  2. Cryomilling (फोम निर्माण के लिए वैकल्पिक)
    1. एक laborato के लिए एक 25 एमएल स्टेनलेस स्टील मिलिंग चैम्बर भरेंकीमा बनाया हुआ lyophilized ईसीएम साथ री बॉल चक्की प्रणाली और दो 10 मिमी स्टेनलेस स्टील मिलिंग गेंदों जोड़ें।
    2. बंद और पूरी तरह से 3 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में भरी हुई मिलिंग कक्ष डूब।
    3. चक्की 30 हर्ट्ज (1800 आरपीएम) में 3 मिनट के लिए जमे हुए नमूना।
    4. चरण दोहराएं 1.2.2 और 1.2.3 जब तक ईसीएम एक ठीक पाउडर में मिल्ड है।
      नोट: बार इन चरणों का ईसीएम स्रोतों के बीच भिन्न हो सकते हैं दोहराया जाना चाहिए की संख्या। उदाहरण के लिए, डैट आम तौर पर एक ठीक पाउडर उत्पन्न करने के लिए 3 मिलिंग चक्र की आवश्यकता है।
    5. पाउडर एक गिलास शीशी में एक scoopula का उपयोग कर स्थानांतरण, कसकर सील, और एक desiccator में संग्रहीत करते हैं।
  3. ईसीएम सस्पेंशन तैयारी
    1. ईसीएम (फोम या microcarriers के लिए) या तो कीमा बनाया हुआ (फोम के लिए) या cryomilled की 250 मिलीग्राम बाहर वजन और एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित। क्रमशः कीमा बनाया हुआ ईसीएम और cryomilled ईसीएम की तैयारी के लिए 1.1.6 और खंड 1.2 कदम, देखें।
      नोट: यह प्रोटोकॉल एक 50 मिलीग्राम / एमएल ईसीएम suspen तैयार करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, सायन मानव डैट, सुअर डीडीटी, और सुअर dlv के लिए सिफारिश की है जो। विशिष्ट ईसीएम स्रोत के आधार पर, वर्दी निलंबन अधिक या कम मूल्य उस मात्रा में उत्पन्न किया जा सकता है।
    2. 0.22 एम नः 2 पीओ 4 (5.4 पीएच) अपकेंद्रित्र ट्यूब को बफ़र और ट्यूब पर तरल स्तर को चिह्नित 5 एमएल जोड़ें।
    3. 1 एमएल 0.22 एम नः 2 पीओ 4 (पीएच 5.4) बफर करने के लिए α-amylase की 7.5 मिलीग्राम जोड़कर एक α-amylase शेयर समाधान तैयार करें। α-amylase शेयर समाधान के 100 μL जोड़ें; नमूना करने के लिए (α-amylase की 0.75 मिलीग्राम 0.3% सूखी ऊतक के / डब्ल्यू डब्ल्यू)। 0.22 एम नः 2 पीओ 4 से 10 एमएल की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए जोड़ें।
    4. कमरे के तापमान पर 72 घंटे के लिए 300 rpm पर लगातार निलंबन आंदोलन।
    5. 10 मिनट के लिए 1500 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र। ध्यान से इकट्ठा करने और पचा ईसीएम गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागने। Resuspend 5% के 10 एमएल सोडियम क्लोराइड में pelleted सामग्री DDH 2 ओ में पतला
    6. DDH 2 ओ में 5% सोडियम क्लोराइड के साथ दो rinses की कुल के लिए दोहराएँ कदम 1.3.5
    7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और DDH 2 ओ के 10 एमएल में pelleted सामग्री फिर से निलंबित
    8. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 rpm पर लगातार निलंबन आंदोलन।
    9. 10 मिनट के लिए 1500 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र। ध्यान से इकट्ठा करने और पचा ईसीएम गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागने।
    10. 5 एमएल कदम 1.3.2 में किए गए निशान के 0.2 एम एसिटिक एसिड जोड़ें।
    11. 120 rpm हे / एन में लगातार निलंबन आंदोलन 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    12. एक हाथ से आयोजित एक देखा दांत 10 मिमी विस्तृत जांच के साथ सुसज्जित जब तक नहीं दिखाई टुकड़े रहने homogenizer का उपयोग कर दस सेकंड के अंतराल में कमरे के तापमान पर ईसीएम निलंबन homogenize। गर्म होने को रोकने के लिए एकरूपता अंतराल के बीच ठंडे पानी की एक बीकर में निलंबन रखें।
      नोट: ईसीएम स्रोत के आधार पर, 0.2 एम एसिटिक एसिड में आगे कमजोर पड़ने एक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। एईसीएम निलंबन की xcessive ठंडा चिपचिपापन में वृद्धि है कि कुशल एकरूपता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हो सकता है। चिपचिपापन में वृद्धि का उल्लेख किया गया है, तो नमूना 37 डिग्री सेल्सियस के लिए rewarmed और आगे की प्रक्रिया के अधीन किया जा सकता है।
    13. अप करने के लिए एक महीने के फोम या microcarrier निर्माण करने से पहले के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. ईसीएम व्युत्पन्न फोम निर्माण

  1. 120 rpm पर निरंतर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कदम 1.3.13 से ईसीएम निलंबन (कीमा बनाया हुआ या cryomilled) सेते हैं जब तक निलंबन गर्म है।
  2. वांछित एकाग्रता के लिए अम्लीय 0.2 एम एसिटिक में ईसीएम निलंबन पतला।
    नोट: - 100 मिलीग्राम / एमएल, के साथ 15 - डैट, डीडीटी और dlv के लिए सिफारिश की सीमा के रूप में 50 मिलीग्राम / एमएल ईसीएम स्रोत के आधार पर, स्थिर फोम 10 की रेंज में तैयार किया जा सकता है। आमतौर पर, उच्च सांद्रता में गढ़े फोम थोड़ा कम झरझरा लेकिन संस्कृति में और अधिक स्थिर और संभाल करने के लिए आसान हो जाएगा।
  3. एक 3 एमएल सिरिंज डब्ल्यू का उपयोग करनाएक 18 जी सुई ईसीएम निलंबन में बुलबुला गठन को रोकने के ith, ईसीएम निलंबन के साथ वांछित मोल्ड भरें। डैट, डीडीटी, और dlv फोम निर्माण करने के लिए, एक 48-अच्छी तरह से सेल संस्कृति का इलाज थाली में 35 मिलीग्राम / एमएल ईसीएम निलंबन के 400 μL बांटना।
    नोट: चयनित मोल्ड के आकार और ईसीएम निलंबन की मात्रा उसके एवज में फोम की ज्यामिति का निर्धारण करेगा।
  4. कवर और उन्हें एक में रखने -20 डिग्री सेल्सियस -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से रातों-रात नए नए साँचे फ्रीज।
    ध्यान दें: ठंड तापमान फोम की सरंध्रता प्रभावित कर सकता है। बड़ी pores उम्मीद कर रहे हैं जब नमूने बड़ा बर्फ के क्रिस्टल 33 के गठन की वजह से डिग्री सेल्सियस -20 पर जमे हुए हैं -80 डिग्री सेल्सियस की तुलना में। एक समान झरझरा संरचना के साथ फोम निर्माण करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि मोल्ड एक प्रवाहकीय सतह दिशात्मक ठंडा को रोकने के लिए के साथ संपर्क में नहीं है।
  5. एक lyophilizer फ्लास्क में जमे हुए नमूनों युक्त नए नए साँचे रखें। laborat को lyophilizer कुप्पी कनेक्ट करेंory फ्रीज ड्रायर सिस्टम और 24 घंटे के लिए सूखी।
    नोट: ऐसा नहीं है कि नमूना lyophilization से पहले के जमे रहने के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. एक desiccator में lyophilized फोम स्टोर जब तक की आवश्यकता है।

3. ईसीएम व्युत्पन्न Electrospraying के माध्यम से microcarrier निर्माण

नोट: electrospraying की स्थापना का अवलोकन चित्र 2 में दिखाया गया है।

  1. 100 आरपीएम हे / एन में निरंतर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कदम 1.3.13 से cryomilled ईसीएम निलंबन सेते हैं।
    नोट: Cryomilled ईसीएम ईसीएम व्युत्पन्न microcarriers निर्माण निलंबन में अधिक से अधिक एकरूपता सुनिश्चित करने और electrospraying दौरान जाम को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. लोड 3 एक 3 मल लूएर ताला सिरिंज में ईसीएम निलंबन की एमएल और एक पंख जलसेक सिरिंज के बोर पर सेट देते हैं।
    नोट: सुई गेज की एक श्रेणी, इस्तेमाल किया जा सकता मान्यता है कि चयन के आकार और उसके एवज में microcarriers की आकृति को प्रभावित कर सकते हैं। fabricat करने के लिएई डैट, डीडीटी, और dlv microcarriers, एक 25 जी सुई का उपयोग करें।
  3. सिरिंज पंप के भीतर सिरिंज सुरक्षित करें। एक प्रत्युत्तर खड़े करने के लिए सुई जकड़ना और 4 की दूरी पर खड़ी सुई टिप स्थिति - एक कम प्रपत्र Dewar फ्लास्क के ऊपर से 6 सेमी (250 - 500 एमएल आकार सीमा अनुशंसित)।
  4. सुई की नोक के लिए एक मगरमच्छ क्लिप इलेक्ट्रोड संलग्न करें और यह उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति के धनात्मक टर्मिनल से कनेक्ट।
  5. वैक्यूम फ्लास्क के किनारे पर एल्यूमीनियम पन्नी (12 x 5 सेमी) की एक पट्टी गुना।
  6. पन्नी के बाहरी छोर के लिए एक दूसरी मगरमच्छ क्लिप इलेक्ट्रोड संलग्न करें और यह बिजली की आपूर्ति की जमीन स्रोत टर्मिनल से कनेक्ट।
  7. ऊपर से लगभग 1 सेमी करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ Dewar फ्लास्क भरें ताकि ¾ की पन्नी जलमग्न है।
    नोट: यह तरल नाइट्रोजन से भर Dewar फ्लास्क रखने के लिए महत्वपूर्ण है। तरल नाइट्रोजन की सतह electrospraying की प्रक्रिया के दौरान कोई कुप्पी के ऊपर से 2 सेमी से कम होना चाहिएरों। तरल नाइट्रोजन की सतत refilling electrospraying दौरान एक निरंतर स्तर को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
  8. 30 एमएल / घंटा की एक जलसेक दर करने के लिए सिरिंज पंप सेट करें।
    नोट: जलसेक दर परिवर्तनीय microcarrier आकार और व्यास को बदल सकते हैं, लेकिन अनुशंसित सीमा 25 है - 35 एमएल / एच। हालांकि यह निलंबन का चिपचिपापन पर बहुत निर्भर है, 25 एमएल / एच नीचे प्रवाह दरों बड़ा microcarriers की पीढ़ी में हो सकता है। बहुत कम प्रवाह दरों पर, आकार और microcarriers के आकार कम सजातीय बन सकते हैं। ऊपर 35 एमएल / एच अर्क दरों में electrospraying द्वारा उत्पन्न बूंदों की एकरूपता बाधित हो सकते हैं, एक व्यापक आकार के वितरण 34 के साथ गैर गोलाकार microcarriers हो जाती है।
  9. 20 केवी की एक वोल्टेज लागू करें और electrospraying आरंभ करने के लिए सिरिंज पंप को चालू करें।
    नोट: वोल्टेज धुन पर microcarriers का आकार अलग किया जा सकता है और जाता है infusio से व्यास पर ज्यादा प्रभाव पड़ता हैn दर। 25 केवी - सिफारिश की वोल्टेज रेंज 15 है। Microcarrier व्यास में कमी वोल्टेज 35 में वृद्धि के साथ की उम्मीद है।
  10. एक बार जब अर्क पूरा हो गया है, ध्यान से Dewar से अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन बंद डालना, microcarriers तरल नाइट्रोजन के ~ 25 एमएल में निलंबित कर दिया छोड़ने सुनिश्चित करने के लिए वे जमे हुए रहते हैं।
  11. इसके तत्काल बाद एक चिकनी गति में डालने का कार्य द्वारा एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में तरल नाइट्रोजन के साथ microcarriers हस्तांतरण। एक scoopula साथ Dewar में शेष किसी भी जमे हुए microcarriers इकट्ठा करने और उन्हें अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें।
    नोट: Dewar के आकार पर निर्भर करता है, तरल नाइट्रोजन में microcarriers शुरू में एक मध्यम आकार के बर्तन में डाल दिया, और फिर 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में तुरंत स्थानांतरित किया जा सकता है।
  12. एल्यूमीनियम पन्नी lyophilization के लिए तैयारी में छोटे छेद के साथ छिद्रित साथ तरल नाइट्रोजन में microcarriers युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब कवर।
  13. कवर अपकेंद्रित्र रखेंएक lyophilizer फ्लास्क में ट्यूबों। इसके तत्काल बाद lyophilizer को कुप्पी कनेक्ट और नमूने हे / एन सूखी।
    नोट: यह microcarriers तरल नाइट्रोजन में निलंबित कर दिया सुनिश्चित करने के लिए वे इस कदम से पहले पिघलना नहीं है रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है के रूप में विगलन पतन और / या एकत्रीकरण में हो सकता है। आकार में सुक्ष्ममापी 500 - 35 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर गढ़े डैट, डीडीटी और dlv microcarriers electrospraying की स्थिति में ऊपर वर्णित का उपयोग कर आम तौर पर एक हाइड्रेटेड व्यास 350 के बीच लेकर होगा। आकार के वितरण ईसीएम स्रोत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  14. एक desiccator में lyophilized microcarriers स्टोर जब तक की आवश्यकता है।

चित्र 2
चित्रा 2. microcarrier निर्माण में प्रयोग किया जाता Electrospraying उपकरण का अवलोकन। उ: छवि सिरिंज पंप सहित प्रमुख electrospraying उपकरणों की व्यवस्था दिखाऔर उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति, साथ ही तरल नाइट्रोजन के Dewar को सुई रिश्तेदार की स्थिति। बी: Electrospraying योजनाबद्ध, वोल्टेज, जलसेक दर और दूरी, के लिए सिफारिश की पर्वतमाला भी शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. foams और सेल संस्कृति के लिए तैयार कर रहा है Microcarriers

  1. रिहाइड्रेशन
    1. (: इथेनॉल के 1 के अनुपात foams के लिए ~ 5) एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र अतिरिक्त निरपेक्ष इथेनॉल (~ 99.9%) युक्त ट्यूब में संदंश के साथ lyophilized फोम स्थानांतरित करें। इसी तरह, संग्रह के लिए इस्तेमाल किया मूल अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर अतिरिक्त निरपेक्ष इथेनॉल में lyophilized microcarriers resuspend। एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग करना, किसी भी समुच्चय को हटाने और इच्छित आकार श्रेणियों के लिए चयन करने के लिए एक नया 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक परिभाषित जाल आकार के साथ एक स्टेनलेस चलनी के माध्यम से microcarriers फ़िल्टर करें।
      नोट: फोम TCPS प्लेटों के भीतर निर्मित कर रहे हैं, वे इन वाहिकाओं के भीतर सीधे rehydrated जा सकता है।
    2. 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं या जब तक फोम या microcarriers है गुरुत्वाकर्षण अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए बस गए। बाँझ अभिकर्मकों और उचित अपूतित तकनीक का उपयोग कर एक लामिना का प्रवाह हुड में बाद के सभी चरणों को पूरा करने।
    3. एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर निरपेक्ष इथेनॉल निकालें और अतिरिक्त जोड़ें: scaffolds के लिए (5 1 के अनुपात) 95% इथेनॉल बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ पतला। 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं या जब तक ईसीएम व्युत्पन्न scaffolds पुनर्जलीकरण पोत की तह तक डूब गया।
    4. धीरे-धीरे एक इथेनॉल श्रृंखला (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 और 0%, बाँझ पीबीएस से पतला) के माध्यम से scaffolds rehydrate। हर कदम पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक scaffolds समाधान बदलने से पहले पोत की तह तक डूब गया। प्रकाश निर्वात के तहत scaffolds देगास अगर scaffolds के भीतर बुलबुला गठन ओ बीएस हैerved।
    5. अवशिष्ट इथेनॉल दूर करने के लिए एक अतिरिक्त दो rinses के लिए बाँझ पीबीएस बदलें।
    6. सेल संस्कृति के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 100% बाँझ पीबीएस में स्टोर। पुनर्जलीकरण निम्नलिखित 2 सप्ताह - 1 भीतर मचानों का प्रयोग करें।
  2. सेल सीडिंग के लिए तैयारी
    1. बोने से पहले दिन पर, सेल संस्कृति में अच्छी तरह से इलाज किया प्लेटों या transwell आवेषण में संदंश का उपयोग कर फोम हस्तांतरण और पर्याप्त सेल संस्कृति माध्यम (ब्याज की कोशिका प्रकार के आधार पर चुना) पूरी तरह से scaffolds (जैसे, 2.5 एमएल / में पाड़ डूब में जोड़ें एक 12 अच्छी तरह से थाली)। इसी तरह, की अनुमति देने के गुरुत्वाकर्षण के microcarriers, अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर बसने ध्यान से microcarriers को परेशान किए बिना एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर पीबीएस निकालें और 5 प्राप्त करने के लिए सेल संस्कृति मध्यम जोड़ें: microcarriers के माध्यम के 1 अनुपात।
      नोट: मानव ASCs बोने के लिए, Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) का उपयोग: हैम के F12 पोषक तत्व मिश्रण के साथ पूरक10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन।
    2. एक कुल्ला के लिए कुल सेल संस्कृति मध्यम बदलें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति माध्यम में scaffolds रातोंरात संतुलित करना। scaffolds सेल अगले दिन बोने के लिए तैयार हो जाएगा।
      नोट: फोम स्थिर सेल संस्कृति आवेषण या टिशू कल्चर अच्छी तरह प्लेटें 29 में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, या गतिशील रूप से एक प्रयोगशाला शेकर 36 का उपयोग कर वरीयता प्राप्त। ईसीएम स्रोत, प्रसंस्करण विधियों और निलंबन एकाग्रता पर निर्भर करता है, गतिशील बोने प्रारंभिक सेल लगाव, प्रसार और घुसपैठ में वृद्धि हो सकती है। Microcarriers एक स्पिनर संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए 11 गतिशील वरीयता प्राप्त किया जा सकता है।

Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, हम का प्रदर्शन है कि तकनीक ऊतक विशेष ईसीएम स्रोत के रूप में decellularized ऊतकों की एक किस्म (का उपयोग कर bioscaffolds उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में मानव डैट, सुअर डीडीटी, और सुअर dlv का उपयोग कर ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers गढ़े है चित्रा 1)। दोनों फोम और microcarrier निर्माण के लिए, α-amylase 37 ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम के साथ कोलेजन solubilization की Nishihara तकनीक decellularized ऊतक शुरू कर सामग्री है, जो नियंत्रित ठंड और lyophilization प्रक्रियाओं के माध्यम से bioscaffolds के संश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है से एक चिपचिपा ईसीएम निलंबन उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया गया था।

फोम निर्माण करने के लिए, decellularized ऊतकों या तो यांत्रिक नख़रेबाज़ या सतह क्षेत्र एंजाइमी पाचन से पहले बढ़ाने के लिए cryomilling के माध्यम से संसाधित किया जा सकता। निम्नलिखित45, उपचार और एकरूपता -amylase, उसके एवज में ईसीएम निलंबन उपयोगकर्ता परिभाषित ढालना है, जो तब स्थिर और lyophilized है में वितरित कर दिया जाता। scaffolds समय की एक विस्तारित अवधि के लिए एक सूखी राज्य में स्थिरतापूर्वक संग्रहित किया जा सकता। सेल संस्कृति के अध्ययन में उपयोग करने से पहले, lyophilized scaffolds एक नियंत्रित पुनर्जलीकरण प्रक्रिया है कि झरझरा और अत्यधिक हाइड्रेटेड सजातीय शुद्ध ईसीएम (चित्रा 3 ए) से व्युत्पन्न फोम पैदावार के अधीन किया जाना चाहिए। फोम बहुत जल्दी rehydrated रहे हैं, तो तेजी से सूजन नाजुक संरचनात्मक विशेषताओं को नुकसान हो सकता, अखंडता और संरचनात्मक पतन की हानि हो जाती है। सामान्य तौर पर, फोम आकार मूल ढालना निम्नलिखित पुनर्जलीकरण द्वारा परिभाषित को बनाए रखने और रासायनिक तिर्यक की आवश्यकता के बिना स्थिर रहे हैं होगा। चित्रा 3 बी प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) डैट, डीडीटी की छवियों से पता चलता है, और dlv 35 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता और -80 & # की ठंड के तापमान पर cryomilled ईसीएम के साथ गढ़े फोम176; सी।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि -80 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिलीग्राम / एमएल और जमे हुए की एकाग्रता पर डैट, डीडीटी, और Cryomilled ईसीएम निलंबन के साथ dlv Foams गढ़े की छवियाँ। एक: डैट, डीडीटी, और dlv के macroscopic दृश्य 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट ढालना पुनर्जलीकरण निम्नलिखित में संश्लेषित फोम मिल्ड। स्केल सलाखों 1 सेमी प्रतिनिधित्व करते हैं। बी: एक सजातीय झरझरा फैटी दिखा डैट, डीडीटी, और dlv फोम की SEM छवियाँ। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Cryomilled ईसीएम निलंबन भी (चित्रा 2 electrospraying तकनीकों के माध्यम से शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न microcarriers उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (चित्रा 4 ए) के बाद व्यास में 500 सुक्ष्ममापी - प्रत्येक ईसीएम स्रोत, निलंबन एकाग्रता, सुई गेज, जलसेक दर, और वोल्टेज के लिए असतत गोलाकार 350 से लेकर microcarriers उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता। microcarriers एक lyophilized राज्य में संग्रहित किया जा सकता है, यह से निपटने है कि वे समाप्त या इथेनॉल में मेजबान निम्नलिखित एक वांछित आकार सीमा को sieved कर रहे हैं में आसानी के लिए सिफारिश की है। SEM इमेजिंग पता चलता है कि microcarrier फैटी decellularized ऊतक स्रोत (चित्रा 4 बी) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।

चित्रा 4
चित्रा 35 मिलीग्राम / एमएल, 0.5 एमएल / मिनट की एक आसव दर, और 20 केवी के एक एप्लाइड वोल्टेज की एकाग्रता पर डैट, डीडीटी, और Cryomilled ईसीएम निलंबन के साथ dlv Microcarriers गढ़े की 4. प्रतिनिधि छवियाँ। एक: Macroscopic दृश्य ओहाइड्रेटेड डैट, डीडीटी, और dlv microcarriers च। स्केल सलाखों 4 मिमी प्रतिनिधित्व करते हैं। बी: दिखा रहा है कि फैटी और आकार ईसीएम स्रोत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं डैट, डीडीटी, और dlv microcarriers की SEM छवियाँ। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Scaffolds के यांत्रिक गुणों ईसीएम स्रोत पर निर्भर हैं, प्रसंस्करण की पद्धति लागू (यानी cryomilling बनाम नख़रेबाज़), ईसीएम निलंबन एकाग्रता, और ठंड तापमान। सामान्य तौर पर, मचान, मुलायम और पालन करने वाले 1 की श्रेणी में यंग moduli साथ - (- 50 मिलीग्राम / एमएल 20) 31, और <1 5 किलो पास्कल डैट (50 और 100 मिलीग्राम / एमएल) 29 और dlv फोम के लिए सूचना microcarriers के लिए किलो पास्कल। cryomilled फोम आम तौर वें नरम हैंएक कीमा बनाया हुआ उनके अधिक बाधित प्रकृति के कारण फोम। विशेष यांत्रिक परीक्षण अत्यधिक संवेदनशील लोड कोशिकाओं के साथ सुसज्जित सिस्टम संपीड़न संपत्तियों की सटीक विशेषता के लिए आवश्यक हैं। आमतौर पर, फोम और microcarriers एंजाइमी पाचन और एकरूपता है, साथ ही scaffolds के गैर सहसंयोजक तिर्यक प्रकृति सहित निर्माण में शामिल अतिरिक्त संसाधन चरणों की वजह से देशी decellularized ऊतकों की तुलना में कम moduli होगा। बहरहाल, यह ब्याज की ऊतक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, पिछले काम में, हमने पाया कि कीमा बनाया हुआ डैट उच्च ईसीएम सांद्रता में गढ़े फोम (100 मिलीग्राम / एमएल) देशी वसा ऊतकों 29 के समान moduli था।

Rehydrated ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers स्थिर या गतिशील संस्कृति शर्तों के तहत कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है इन विट्रो सेल संस्कृति के अध्ययन और / ओ के लिए एक सेल सहायक मंच प्रदान करनाविवो सेल वितरण में आर। scaffolds आम तौर पर सेल लगाव समर्थन करते हैं, बोने दक्षता ईसीएम स्रोत, पाड़ ज्यामिति और सरंध्रता, और ब्याज की कोशिका प्रकार पर निर्भर करेगा। जैसे, बोने के तरीकों और घनत्व उपयोगकर्ता परिभाषित शर्तों के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता होगी। 1 x 10 6 कोशिकाओं / पाड़ एक कक्षीय शेकर पर सेल घुसपैठ बढ़ाने के लिए, गतिशील बोने के साथ - के लिए फोम ऊपर वर्णित है, हम एक प्रारंभिक सेल एकाग्रता 0.25 की रेंज में सलाह देते हैं। Microcarriers के लिए, हम 25,000 की रेंज में एक प्रारंभिक बोने घनत्व का सुझाव - 50,000 कोशिकाओं microcarriers की / मिलीग्राम, एक स्पिनर संस्कृति कुप्पी 11 में गतिशील परिस्थितियों में प्रदर्शन किया बोने के साथ। चित्रा 1 के नीचे दिखाया छवियों मानव ASCs, एक डैट फोम (बाएं) या डैट microcarrier पर वरीयता प्राप्त (ठीक है, एक एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई के साथ prelabeled और नीले रंग के 13 प्रदर्शित होने) के रूप में कोंफोकल सूक्ष्म द्वारा कल्पना का प्रतिनिधित्वscopy एक फ्लोरोसेंट सेल व्यवहार्यता दाग का उपयोग कर (जीवित कोशिकाओं = हरे, मृत कोशिकाओं = लाल; पैमाना सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं)। कोंफोकल माइक्रोस्कोपी मोटाई में 2 मिमी अप करने के लिए फोम की सतह पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन scaffolds के केंद्रीय क्षेत्रों में दृश्य उनके अपारदर्शी प्रकृति द्वारा सीमित है। हालांकि, फोम और microcarriers ऊतकों के रूप में इलाज किया जा सकता है और तेल-एम्बेडेड या क्रायो-sectioned ऊतकीय और प्रतिरक्षाऊतकरसायन के लिए सेल वितरण और मार्कर अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए विश्लेषण करती है।

Discussion

सामान्य तौर पर, decellularized ऊतकों से प्राप्त bioscaffolds और अधिक बारीकी से जटिल 3 डी संरचना और देशी सेलुलर सूक्ष्म पर्यावरण में ईसीएम की संरचना का अनुमान लगा सकता सिंथेटिक scaffolds या मानक संस्कृति मॉडल 2 डी TCPS के आधार पर की तुलना में। पहले चर्चा के रूप में, सेल ईसीएम बातचीत दोनों संस्कृति में और शरीर 1 में सेलुलर व्यवहार में मध्यस्थता करने में गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। यह मानते हुए कि ईसीएम के, जैव रासायनिक जैवभौतिक, और जैवयांत्रिकी गुण प्रत्येक ऊतक के लिए अद्वितीय हैं, वहाँ के रूप में भी अधिक के विकास में, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए biomaterials के डिजाइन में ऊतक विशेष दृष्टिकोण को लागू करने के लिए तर्क के समर्थन के प्रमाण बढ़ती जा रही है इन विट्रो प्रयोगों 20 के लिए physiologically प्रासंगिक संस्कृति मॉडल। एक शुरू करने सामग्री के रूप में decellularized ऊतकों का उपयोग, हमारे तरीकों को और अधिक ग्राहक भीतर ऊतक विशेष ईसीएम की जटिल संरचना शामिल कर सकते हैंomizable पाड़ प्रारूपों। यांत्रिक और एंजाइमी संसाधन चरणों देशी ईसीएम फैटी का नुकसान में परिणाम होगा, वहीं डैट के साथ पिछले अध्ययनों ने दिखाया है कि वसा व्युत्पन्न ईसीएम के शिक्षाप्रद प्रभाव इन पाड़ स्वरूपों में संरक्षित कर रहे हैं, सुझाव है कि bioscaffold रचना एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ है सेल समारोह 11, 29 की। सेल संस्कृति substrates के रूप में ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers का उपयोग कर बरकरार decellularized ऊतकों की तुलना में करने के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि वे अधिक सजातीय हैं, जो कोशिका वितरण और सेल सेल / सेल ईसीएम बातचीत में एकरूपता में सुधार कर सकते है।

यहाँ वर्णित तरीकों सेल संस्कृति और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए ऊतक विशेष bioscaffolds की एक व्यापक श्रेणी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता। उदाहरण के लिए, डैट, डीडीटी, और dlv के अलावा, हमारे प्रयोगशाला सफलतापूर्वक इन तकनीकों 3 डी पोर उत्पन्न करने के लिए आवेदन किया हैous फोम decellularized हड्डी, उपास्थि, नाभिक pulposus, और वलय फाइब्रोसिस, साथ ही वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध, अघुलनशील कोलेजन गोजातीय कण्डरा से प्राप्त का उपयोग कर। एक इन विट्रो दृष्टिकोण से, इन bioscaffolds एक आधार के रूप में उच्च निष्ठा 3 डी संस्कृति मॉडल के लिए कोशिका जीव विज्ञान, शरीर विज्ञान या रोग विकृति 38 की जांच के लिए, उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों 39, या स्टेम के लिए के रूप में शिक्षाप्रद मैट्रिक्स में जैवसक्रिय substrates के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता सेल भेदभाव 40, 41। डैट, डीडीटी और dlv फोम 25 की सांद्रता में गढ़े - 50 मिलीग्राम / एमएल इन विट्रो संस्कृति (28 दिनों के लिए परीक्षण किया) में लंबी अवधि में स्थिर रहे हैं। कम से कम 2 सप्ताह के लिए - (15 आरपीएम 10) इसके अलावा, microcarriers के सभी तीन प्रकार के एक कम कतरनी स्पिनर संस्कृति प्रणाली में सेल लगाव और गतिशील परिस्थितियों में प्रसार का समर्थन कर सकते हैं। इन विवो अनुप्रयोगों के लिए, biocompatible और biodegradable ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers रचनात्मक ऊतक remodeling और उत्थान 11, 29 प्रोत्साहित करने के लिए ऑफ-द-शेल्फ उत्पादों के रूप में वादा पकड़। इसके अलावा, सेल चिपकने वाला scaffolds सेल थेरेपी वितरण प्रणाली 42, 43 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। उदाहरण के लिए, डैट फोम जब अनुवांशिक रूप से भिन्न ASCs के साथ वरीयता प्राप्त और एक असुरक्षित चूहे मॉडल 29 में subcutaneously प्रत्यारोपित एंजियोजिनेसिस और वसाजनन बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। बरकरार डैट के सापेक्ष, अधिक उच्च संसाधित डैट और अधिक तेजी से अपमानित फोम मात्रा में 50% की कमी के साथ, 3 सप्ताह में उल्लेख के रूप में वे 12 सप्ताह से मेजबान ऊतकों के साथ एकीकृत हो गया है, और लगभग पूरा हो गया अवशोषण। हालांकि, फोम भी एक अधिक शक्तिशाली वाहिकाजनक प्रतिक्रिया प्रेरित हुए यह कहा कि एंजाइम पचा ईसीएम अद्वितीय समर्थक पुनर्योजी प्रभाव पड़ा। इसी प्रकार, ईसीएम व्युत्पन्न microcarriers इन विट्रो के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता </ em> गतिशील संस्कृति प्रणालियों के भीतर सेल संस्कृति substrates और के रूप में इंजेक्शन सेल वितरण वाहनों 11, 30, 44। विशेष रूप से, microcarriers के छोटे व्यास और बड़े सतह क्षेत्र है, जबकि एक मैट्रिक्स सेल व्यवहार्यता का समर्थन और इंजेक्शन 30 के स्थल पर सेल प्रतिधारण बढ़ाने के लिए मदद कर सकते हैं प्रदान करने, एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा का वितरण सक्षम हो सकता है। किसी भी जीवित प्रणाली में उपयोग करने से पहले, यह सुनिश्चित करना है कि स्रोत ईसीएम प्रतिजनी सेलुलर घटकों और / या संभावित साइटोटोक्सिक decellularization अभिकर्मकों कि एक नकारात्मक मेजबान प्रतिक्रिया 7 को चालू कर सकते का काफी हद तक रहित है महत्वपूर्ण है।

प्रोटियोलिटिक एंजाइम पेप्सिन सामान्यतः ईसीएम व्युत्पन्न हाइड्रोजेल 15 की तैयारी में इस्तेमाल किया जाता है। पेप्सिन एक गैर विशिष्ट प्रोटीज कि कोलेजन और अन्य ईसीएम प्रोटीन int पचाने जाएगाओ छोटे टुकड़ों 45। जबकि पेप्सिन-पचा ईसीएम से निर्मित हाइड्रोजेल सेल शिक्षाप्रद प्रभाव सूचित किया गया है, एक सीमा यह है कि इन सामग्रियों अत्यंत यंत्रवत् कमजोर 46 हो जाते हैं है। डैट microcarriers के बारे में हमारी प्रारंभिक विकास में, हम एक समग्र दृष्टिकोण है, जिसमें पेप्सिन-पचा डैट alginate के साथ संयुक्त किया गया था और गोलाकार मोती 30 के रूप में 2 CaCl में dropwise जोड़ा का उपयोग किया। मोती बाद में तस्वीर-तिर्यक थे और alginate सोडियम साइट्रेट का उपयोग कर निकाला गया था। 950 सुक्ष्ममापी 30 - रासायनिक तिर्यक के लिए आवश्यकता के अलावा, एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि microcarriers इस दृष्टिकोण के साथ गढ़े 900 का एक आकार सीमा से नीचे गरीब स्थिरता था। पेप्सिन के स्थान में, यहाँ प्रस्तुत तरीकों α-amylase ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम है, जो telope से कार्बोहाइड्रेट समूहों तोड़ना को माना गया है के साथ ईसीएम का एक और अधिक हल्के पाचन का उपयोगकोलेजन के ptide क्षेत्रों, जिससे एसिटिक एसिड 37 में घुलनशीलता बढ़ रही है। यह दृष्टिकोण अत्यधिक polymerized कोलेजन कि रासायनिक तिर्यक या अन्य additives की आवश्यकता के बिना शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के अलगाव सक्षम बनाता है। ये bioscaffolds अच्छी तरह से संरक्षित कोलेजन तंतुओं, देशी ईसीएम सूक्ष्म पर्यावरण में कोलेजन के समान के बीच शारीरिक संपर्क और हाइड्रोजन संबंध के माध्यम से स्थिर हो जाता है।

फोम कि चयनित विशिष्ट मोल्ड के आधार पर ज्यामिति की एक विस्तृत श्रृंखला में निर्मित किया जा सकता है एक बेहद लचीला मंच है। सेल संस्कृति अध्ययन के लिए, फोम कोटिंग्स या मोटाई अलग से 3 डी scaffolds के रूप में अच्छी तरह से TCPS प्लेटों में सीधे डाली जा सकती है। बहुत वर्दी सतहों के साथ 3 डी फोम निर्माण करने के लिए, यह अनुशंसित है कि एक कस्टम मोल्ड डिज़ाइन किया गया है कि प्लास्टिक या कांच स्लाइड के साथ दोनों पक्षों पर बंद किया जा सकता। या तो कीमा या cryomilled ईसीएम के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताफोम। सामान्य तौर पर, हमने पाया है कि cryomilled फोम macroscopically नरम हो सकता है और 36 कम सांद्रता 31 पर एक और अधिक बाधित फैटी हो जाते हैं। ऊतक स्रोत के आधार पर, अतिरिक्त यांत्रिक प्रसंस्करण चरणों ईसीएम रचना है कि सेल समारोह पर प्रभाव पड़ सकता में परिवर्तन हो सकता है। उदाहरण के लिए, हमारे पिछले काम में, laminin कीमा बनाया हुआ dlv फोम में पता चला था, लेकिन cryomilled नहीं dlv foams 31। इसके विपरीत, कोलेजन मैं, कोलेजन चतुर्थ, laminin, और फाइब्रोनेक्टिन दोनों कीमा बनाया हुआ में पता चला और cryomilled डैट foams 36 थे। यांत्रिक प्रसंस्करण चरणों के अलावा, फोम की सरंध्रता और छेद के आकार ईसीएम निलंबन एकाग्रता और ठंड तापमान 47 अलग से कुछ हद तक नियोजित किया जा सकता। सामान्य तौर पर, कम एकाग्रता फोम (~ 10 - 15 मिलीग्राम / एमएल) गुणात्मक अधिक झरझरा हैं, लेकिन तेजी से अनुबंध कर सकते हैं और गरीब हैलंबे समय तक संस्कृति 31, 36 में स्थिरता। इसी तरह, एक धीमी ठंड दर, आम तौर पर एक उच्च ठंड तापमान के द्वारा प्राप्त किया, निर्माण 29 के दौरान गठन बर्फ के क्रिस्टल के आकार के कारण फोम में बड़े pores हो सकती है। इन मानकों के सभी सहित लगाव, घुसपैठ, और पुर्ननिर्माण सामग्री, के साथ सेल बातचीत को प्रभावित कर सकते। उदाहरण के लिए, कि उच्च सांद्रता के साथ ईसीएम गढ़े रहे फोम पर कोशिकाओं की वृद्धि, सतह क्षेत्रों तक सीमित किया जा सकता है विशेष रूप से कीमा बनाया हुआ ईसीएम स्रोतों के साथ और स्थिर संस्कृति की स्थिति 36 के तहत।

microcarriers के लिए, कुंजी पैरामीटर नियोजित किया जा सकता ईसीएम निलंबन एकाग्रता, सुई गेज, और लागू वोल्टेज, उच्च सांद्रता आम तौर पर microcarriers कि लंबी अवधि के गतिशील संस्कृति के तहत और अधिक स्थिर रहे हैं उपज के साथ कर रहे हैं। electrospraying की दीक्षा के बाद, ईसीएम सस्पेंसआयन बूंदों जल्दी से, कुप्पी के केंद्र में गिर चाहिए एल्यूमीनियम पन्नी कलेक्टर की दिशा की ओर। एकत्रीकरण रोकने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि मोती पन्नी से पहले तरल नाइट्रोजन से संपर्क करें। सुई और तरल नाइट्रोजन की सतह के बीच की दूरी इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता। यह नोट करना एकाग्रता रेंज है कि स्थिर bioscaffolds उत्पन्न होगा के चयन में है कि अनुकूलन प्रत्येक विशिष्ट ईसीएम स्रोत के गुणों के आधार पर आवश्यक हो सकता है, विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक है कि decellularization तरीकों कि ईसीएम या अवशिष्ट अभिकर्मकों (जैसे, सर्फेकेंट्स) की उपस्थिति नकारात्मक परिणामी फोम और microcarriers की स्थिरता को प्रभावित कर सकते नीचा के रूप में शुरू सामग्री उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है decellularization प्रोटोकॉल है। चुनौतियों bioscaffold स्थिरता, विकल्प है कि एक अधिक क्रमिक पुनर्जलीकरण प्रक्रिया का उपयोग शामिल है जांच की जा सकती है, ईसीएम susp में वृद्धि के साथ सामना करना पड़ा रहे हैंension एकाग्रता, और cryomilled ईसीएम बनाम कीमा बनाया हुआ की खोज। इन विकल्पों में से सभी समस्या को हल करने के लिए असफल हो, यह विकल्प decellularization प्रोटोकॉल या ईसीएम स्रोतों का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है।

पाड़ उत्पादन के दौरान reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, विशेष देखभाल प्रोटोकॉल में कुछ चरणों में लिया जाना चाहिए। जब decellularized ऊतकों cryomilling, यह अनुशंसित है कि मिलिंग वातावरण से नमी की अवशोषण की वजह से तुरंत एक सूखी कण एकत्रीकरण की संभावना को कम करने के लिए वातावरण में lyophilization के बाद आयोजित किया। microcarrier निर्माण के दौरान, यह सुझाव दिया है कि निलंबन 3 एमएल की एक अधिकतम मात्रा के साथ, छोटे बैचों में electrosprayed है, नमूना ठंडा के साथ मुद्दों है कि सुई के जाम में परिणाम कर सकते से बचने के लिए। इसके अलावा, यह जरूरी है कि microcarriers electrospraying प्रक्रिया के बाद पिघलना अनुमति नहीं है। उनके गोलाकार ज्यामिति और यांत्रिक स्थिरता, microcarri बनाए रखने के लिएईआरएस तरल नाइट्रोजन से एकत्र किया जाना चाहिए, एक तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में ले जाया, और तुरंत lyophilized। अंत में, दोनों फोम और microcarriers के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पुनर्जलीकरण चरणों से अधिक दिनों की अवधि में धीरे-धीरे प्रदर्शन कर रहे हैं। रैपिड पुनर्जलीकरण स्थूल और / या सूक्ष्म पैमाने पर संरचनात्मक पतन हो सकता है। इसके अलावा, पुनर्जलीकरण धीरे पाड़ के भीतर छोटे हवाई बुलबुले, जो प्रकाश निर्वात के तहत देगास के लिए समय की एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता होती है सकते हैं के गठन को रोकने के लिए होने चाहिए।

अंत में, इस पत्र में प्रस्तुत तरीकों ऊतक विशेष फोम और microcarriers शुद्ध, गैर रासायनिक तिर्यक ईसीएम के शामिल की एक विविध सरणी निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैविक शोधकर्ताओं के लिए एक लाभ यह है कि bioscaffolds संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं और जब इस तरह के ऊतक विज्ञान, इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, या जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति assays के रूप में तकनीक के साथ विश्लेषण प्रदर्शन कर ऊतकों को इसी तरह से संसाधित किया जा सकता है।इसके अलावा, ईसीएम व्युत्पन्न scaffolds enzymatically वरीयता प्राप्त सेल आबादी को निकालने के लिए अवक्रमित हो सकता है या बायोडिग्रेडेबल और biocompatible सेल वितरण वाहनों के रूप में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह लचीला मंच प्रौद्योगिकी 3 डी सेल संस्कृति सेल समारोह की जांच के अध्ययन के लिए सहित कई अनुप्रयोगों के लिए बड़ी उपयोगिता, सेल विस्तार substrates के रूप में रखती है, और के रूप में समर्थक पुनर्योजी bioscaffolds।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid, glacial BioShop ACE222.500
Alligator clip leads VWR 470149-728
Aluminium foil Fisher Scientific 01-213-101
α-amylase Sigma 101074694 from Aspergillus aryzae
Analytical balance Sartorius CPA225D
Centrifuge Thermo Scientific 75004251 With swinging bucket rotor for 15 & 50 mL centrifuge tubes
Centrifuge tubes (15 mL) Sarstedt 62.554.205
Centrifuge tubes (50 mL) Sarstedt 62.547.205
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) Sigma C9879  Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers
Cryomilling system Retsch 20.745.0001 MM 400
Dessicator Fisher Scientific 8624426 For lyophilized ECM and bioscaffold storage
DMEM: F12 Hams Sigma D6421 Used for proliferation media
Dewar flask Fisher Scientific 10-196-6 Low form; volume range of 250 - 500 mL
Double distilled water (ddH2O) From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System
D-PBS (Phosphate-buffered Saline) Wisent 311425125
ECM (Extracellular Matrix) Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ethanol Greenfield Specialty Alcohols Inc. P016EAAN Absolute
Fetal bovine serum (FBS) Wisent 80150 Used for proliferation media
Forceps VWR 37-501-32 For transferring the foams
Freezer (-20 °C) VWR 97043-346
Freezer ( -80 °C) Thermo Scientific EXF40086A
Glass vials Fisher Scientific 03-339-26D To store lyophilized cryomilled ECM
Hand held homogenizer Fisher Scientific 14-359-251 Speed: 8,000 - 30,000 rpm
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes Fisher Scientific 14-261-17 10 x 95 mm
Liquid nitrogen For electrospraying
Lyophilizer Labconco 7750021 FreeZone4.5
Milling chamber Retsch 02.462.0213 25 mL volume recommended
Milling balls VWR 16003-606 10 mm diameter, stainless steel recommended
18 G needle VWR C ABD305185 For dispensing ECM suspension into moulds
Orbital incubator shaker SciLogex 832010089999 Temperature controlled (37 °C)
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140-122 Used for proliferation media
Pipet-Aid XP Mandel Scientific DRU-4-000-101
Retort stand VWR 470019-526
Retort stand clamp VWR 21573-606
Safety-Lok Syringe BD 309606 3 mL Luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension
Serological pipettes (10 mL) Sarstedt 86.1254.001
Serological pipettes (25 mL) Sarstedt 86.1685.001
Sodium chloride BioShop 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic BioShop 10049-21-5
Scoopula VWR 89259-968 For collecting microcarriers
Surgical scissors VWR 82027-590
Syringe pump VWR 10117-490 Microprocessor controlled
High voltage power supply Gamma High Voltage Research ES30P-5W/DDPM Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range
12-well plates Fisher Scientific 12565321 For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected
Winged infusion set Terumo 22258092 30 cm tubing length, 25 G 3/4" recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter

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जैव अभियांत्रिकी अंक 122 बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोलेजन पाड़ फोम microcarrier decellularization बायोइन्जिनियरिंग ऊतक विशेष सूक्ष्म पर्यावरण शिक्षाप्रद सेल संस्कृति ऊतक इंजीनियरिंग
बाह्य मैट्रिक्स व्युत्पन्न foams और ऊतक विशेष सेल संस्कृति और प्रसव के प्लेटफार्म के रूप में Microcarriers का निर्माण
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Kornmuller, A., Brown, C. F. C., Yu, … More

Kornmuller, A., Brown, C. F. C., Yu, C., Flynn, L. E. Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55436, doi:10.3791/55436 (2017).

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