Summary
Aqui apresentamos um protocolo para a detecção da expressão de microRNA na membrana peritoneal de ratos utilizando uma reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa. Este método é adequado para estudar o perfil de expressão de microARN na membrana peritoneal de ratos em várias condições patológicas.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são pequenos ARNs não codificados que regulam a expressão de ARN mensageiro pós-transcrição. O perfil de expressão de miARN foi investigado em vários órgãos e tecidos em ratos. No entanto, os métodos padrão para a purificação de miRNAs e a detecção de sua expressão na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos. Desenvolvemos um método eficaz e confiável para purificar e quantificar miARNs usando reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa (qRT-PCR) em membrana peritoneal de rato. Este protocolo consiste em quatro etapas: 1) purificação da amostra de membrana peritoneal; 2) purificação do ARN total, incluindo o miARN da amostra de membrana peritoneal; 3) transcrição reversa de miARN para produzir cDNA; E 4) qRT-PCR para detectar a expressão de miARN. Usando este protocolo, determinamos com sucesso que a expressão de seis miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p) aumentaramSignificativamente na membrana peritoneal de um modelo de fibrose peritoneal do rato em comparação com aqueles em grupos controle. Este protocolo pode ser usado para estudar o perfil da expressão de miARN na membrana peritoneal de ratos em muitas condições patológicas.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) são curtos, não codificando RNAs que post-transcriptionally regulam o mensageiro RNA (mRNA) expressão 1 . Alterações na expressão de miARNs regulam a expressão de muitos mRNAs que desempenham papéis fundamentais em várias condições patológicas, incluindo câncer, inflamação, distúrbios metabólicos e fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Portanto, os miARN têm potencial como novos biomarcadores e alvos terapêuticos 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . O perfil de expressão de miARN foi determinado em vários ratosÓrgãos e tecidos, incluindo fígado, coração, pulmão e rim 9 . No entanto, os métodos padrão para a purificação e detecção de miRNAs na membrana peritoneal de ratos não foram bem estabelecidos.
O objetivo geral deste protocolo é purificar com sucesso e detectar miARN na membrana peritoneal do rato. Primeiro, a amostra de membrana peritoneal foi homogeneizada usando um homogeneizador de vidro, seguido de exposição a um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga 10 . Em seguida, o ARN total incluindo o miARN foi purificado a partir da amostra de membrana peritoneal usando uma coluna de rotação à base de sílica 10 . Em seguida, o cDNA foi sintetizado a partir do ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e oligo-dT iniciador 11 . Finalmente, a expressão de miARN foi determinada por qRT-PCR usando um corante intercalador 11 . A lógica deste protocolo é bEm estudos anteriores que mostraram uma purificação e detecção significativa de miARN em tecidos por um processo simples 8 , 10 , 11 . Foi relatado que o uso de um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de rotação de microcentrífuga e coluna de rotação baseada em membrana de sílica pode purificar ARN total de alta qualidade a partir dos tecidos 10 . O método de síntese de cDNA a partir de ARN total purificado utilizando transcriptase reversa, poli (A) polimerase e iniciador oligo-dT, e o método de detecção de expressão de miARN por qRT-PCR utilizando corante intercalante neste protocolo foram relatados para mostrar alta precisão e Sensibilidade 11 . Além disso, este é um processo simples, que economiza tempo e evita erros técnicos. Portanto, este protocolo é útil em estudos que requerem detecção altamente precisa e sensível de miARN em membrana peritoneal de ratos em uma ampla gama de condições patológicas.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais de animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade Médica de Jichi e foram realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidados de Animais Experimentais do Guia da Universidade Médica de Jichi para animais de laboratório.
1. Coleção de amostra de peritônio
- Colecione os seguintes itens: tubo de centrífuga de 50 ml com algodão encharcado em isoflurano, folha de cortiça, placa de Petri com solução salina tamponada com fosfato (PBS), tesoura cirúrgica e fórceps.
- Eutanásie um rato com uma overdose de isofluorano, depois pulverize a pele abdominal do rato com 70% de etanol e monte o rato na folha de cortiça nas costas.
- Faça uma incisão longitudinal na pele abdominal, músculo e membrana peritoneal usando a tesoura e fórceps.
- Pegue a membrana peritoneal usando a pinça e faça incisões horizontais na sua parte superior ao longo do osso mais baixo da costela sob o diafragma e no seu lOwer lado na região lateral usando a tesoura cirúrgica. Em seguida, faça incisões longitudinais laterais para remover a membrana peritoneal do corpo usando as tesouras cirúrgicas. Em seguida, lave-o com PBS em uma placa de Petri.
- Corte e corte 20 mg (3-5 mm 2 ) de amostras de membranas peritoneais, que é um tamanho adequado para as seguintes etapas, usando a tesoura cirúrgica e fórceps.
2. ARN total purificante de amostras de membrana peritoneal
NOTA: Aqui, amostras de membranas peritoneais pesando 20 mg são homogeneizadas usando um homogeneizador de vidro e um sistema de trituração de biopolímero em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga. Em seguida, o ARN total da amostra de membrana peritoneal é isolado utilizando uma coluna de rotação à base de sílica.
- Coletar os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 ou 2,0 mL, 100% de etanol, clorofórmio, homogeneizador de vidro, gelo, sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de centrifugação de microcentrífuga 10 10 , reagente de lise à base de fenol / guanidina, tampão de lavagem incluindo guanidina e etanol (tampão de lavagem 1) e tampão de lavagem incluindo etanol (tampão de lavagem 2).
- Coloque uma amostra de membrana peritoneal de 20 mg em um homogeneizador de vidro e adicione 700 μL do reagente de lise à base de fenol / guanidina.
- Homogeneizar a amostra de membrana peritoneal pressionando lentamente o pilão sobre a amostra com torção. Repita este processo várias dúzias de vezes em gelo até a amostra de membrana peritoneal se dissolver completamente no reagente de lise à base de fenol / guanidina.
- Para uma maior homogeneização, transferir lisado homogeneizado para o sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de rotação de microcentrífuga em um tubo de coleta de 2,0 mL. Em seguida, centrifugá-lo a 14.000 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Transfira o lisado homogeneizado para um novo tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 140 μL de clorofórmio ao lisado homogeneizado e tapar a cubaE de forma segura. Em seguida, misture o tubo por inversão por 15 s.
- Incubar as amostras durante 2-3 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugá-los a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
- Transfira o sobrenadante (geralmente 300 μL) para um novo tubo de microcentrífuga sem perturbar o precipitado e adicione 1.5x seu volume (geralmente 450 μL) de 100% de etanol. Em seguida, misture a amostra por vórtice por 5 s.
- Pipetar até 700 μL da amostra em uma coluna de rotação à base de sílica colocada em um tubo de coleta de 2,0 mL. Feche a tampa da coluna. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
- Adicione 700 μL de tampão de lavagem 1 à coluna de rotação à base de sílica para lavar rigorosamente a amostra. Feche a tampa da coluna. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
- Adicionar 500 μL de tampão de lavagem 2 à sílica-membColuna de rotação baseada em rane para remover qualquer vestígio de sal. Feche a tampa da coluna. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 15 s. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
- Repita 2.11.
- Centrifugue novamente a coluna de rotação à base de sílica a 15 000 xg durante 1 min. Após a centrifugação, descarte o fluxo no tubo de recolha.
- Coloque a coluna de rotação à base de sílica em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Em seguida, transferir 25 μL de água sem RNase para a coluna. Feche a tampa da coluna. Deixe a amostra à temperatura ambiente durante 5 min. Então, centrifugá-lo em 15.000 xg por 1 min.
- Transfira o eluído de 25 μL contendo RNA total para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, guarde-o a -80 ° C antes de usar.
3. Transcrição reversa do ARN total
NOTA: Referência e adesão à Informação Mínima para Publicação da Experiência quantitativa em PCR em Tempo RealAs diretrizes de iments (MIQE) incentivam melhores práticas e ajudam na obtenção de resultados confiáveis e inequívocos 12 .
NOTA: Aqui, um total de 1,0 μg de ARN isolado é transcrita de forma reversa usando a transcriptase reversa, poli (A) polimerase e iniciador oligo-dT.
- Coletar os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL; Tubos de tiragem de oito poços; Água sem RNase; gelo; Kit de transcriptase reversa (ver tabela de materiais) 11 .
- Prepare uma solução de mistura principal que contenha 2,0 μL de mistura de ácido nucleico 10x, 2,0 μL de mistura de transcriptase reversa (do kit) e 4,0 μL de 5x tampão hi-spec para um total de 8,0 μL por tubo.
- Dispense 8,0 μL de solução de mistura principal (do kit) em cada tubo.
- Meça a quantidade de RNAs totais usando um espectrofotômetro. Adicione 1,0 μg de RNAs isolados purificados da amostra de membrana peritoneal para cada tubo.
NOTA: qRT-PCR pode ser executado usiNg ARNs totais como um modelo sem transcrição reversa para o controle de qualidade de RNAs purificados. Se algum DNA estiver contaminado, os produtos de amplificação inesperados são observados por qRT-PCR. - Adicione água livre de RNase a cada tubo para um total de 20 μL. Em seguida, misture bem por pipetagem e centrifugá-lo por 15 s.
- Incubar as amostras durante 60 min a 37 ° C. Inmediatamente incubar durante 5 min a 95 ° C.
NOTA: Esta etapa pode ser realizada em um termociclador. - Transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrífuga e dilua dez vezes (1:10) com água sem RNase.
- Armazene o cDNA diluído no gelo temporariamente e a -80 ° C por longo prazo antes do uso.
4. qRT-PCR de miARN
NOTA: qRT-PCR de miARN é realizado usando corante intercalante. Aqui, primers para RNA, U6 pequeno nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p foram usados.
- Colecione os seguintes itens: tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, placa de reação de 96 poços para qRT-PCR, filme adesivo para a placa de reação de 96 poços, iniciadores específicos de miARN, kit de PCR com base de corante verde (ver tabela de materiais) 11 e um Instrumento de PCR em tempo real.
- Prepare uma mistura principal contendo 12,5 μL de mistura mestre de PCR 2x, 2,5 μL de 5 μM de implante de miARN dissolvido em água livre de nuclease e 1,25 μL de primário universal 10x para cada poço.
- Distribua 22,5 μL de mistura principal em cada poço da placa de 96 poços.
- Adicione 2,5 μL de ADNc de molde a cada poço.
- Selar a placa com filme adesivo para a placa de reação de 96 poços. Em seguida, centrifugue a placa a 1000 xg por 30 s.
- Execute o programa de ciclagem PCR com o instrumento de PCR em tempo real e o software da seguinte maneira.
- Defina a placa no instrumento de PCR em tempo real. No software de PCR em tempo real, defina propriedades experimentais (entrada experimentalNome, escolha "96-poços" para o tipo de instrumento experimental, escolha "Método 2 - ΔΔCT " para o método de quantificação, escolha "Reagentes verdes SYBR" para o reagente para detectar a seqüência-alvo, escolha "Velocidade de rampa padrão" para o Execução de instrumento).
- Em seguida, atribua nomes às amostras e meta miARNs em cada poço. As amostras são sempre testadas em duplicado ou triplicado para obter dados suficientes para validação dos resultados. Selecione amostra de referência e controle endógeno. Selecione "nenhum" para que o corante use como referência passiva.
- Insira um volume de reação de "20 μL" e as seguintes condições de ciclagem de PCR no software de PCR em tempo real de acordo com as instruções: pré-incubação a 95 ° C por 15 min e então 40 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 15 s , Recozimento a 55 ° C durante 30 s, e extensão a 70 ° C durante 30 s.
- Analise dados qRT-PCR vocêCante o software do instrumento de PCR em tempo real. Confirme se o limite e a linha de base que são determinados automaticamente pelo software são apropriados em cada poço.
- Verifique o ciclo de limiar dos miRNAs alvo em cada amostra. O ciclo limiar é a interseção entre uma curva de amplificação e uma linha de limiar. Então, normalize o nível de expressão dos miRNAs alvo contra RNU6-2 como controle endógeno e calcule o nível de expressão relativa dos miRNAs alvo usando o método 2 - ΔΔCT 13 .
NOTA: Note-se que a estabilidade do nível de expressão do miARN de controle endógeno deve ser verificada. Nesta experiência, a RNU6-2 foi confirmada para ser expressa em alto nível e relativamente invariante em cada grupo.
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Representative Results
Os resultados apresentados aqui são baseados em nosso estudo relatado anteriormente 8 . Nós investigamos o perfil de expressão de miARN na fibrose peritoneal. A fibrose peritoneal é uma importante complicação na diálise peritoneal. É caracterizada pela perda da monocamada de células mesoteliais e pelo excesso de acumulação de componentes da matriz extracelular e está associada à insuficiência da membrana peritoneal 14 , 15 . Um modelo de rato de fibrose peritoneal foi produzido pela injeção intraperitoneal de 100 mL / kg de fluido de diálise peritoneal (2,5% de glicose, 100 mM de NaCl, 35 mM de lactato de sódio, 2 mM de CaCl2 e 0,7 mM de MgCl2 contendo 20 mM de metilglioxal) durante 5 Dias por semana durante 3 semanas para ratos machos, 12 semanas e peso corporal de 230-250 g 16 . Os seguintes grupos serviram como controles: ratos sem qualquer tratamento (ratos simulados) e ratos injetadosCom fluido de diálise peritoneal sem metilglioxal (ratos de controle). Com base no rastreio de microarrays de miARN, descobrimos que os níveis de seis miARNs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p) Significativamente aumentado na membrana peritoneal de ratos de fibrose peritoneal em comparação com aqueles em ratos simulados e ratos de controle, usando qRT-PCR após o protocolo apresentado neste manuscrito ( Figura 1 ) 8 .
Figura 1: MiRNAs com Upregulated na Membrana Peritoneal de Ratos de Fibrose Peritoneal. QRT-PCR determinação da expressão de miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p em ratos simulados (n = 6) , Ratos de controle (n = 6) e ratos de fibrose peritoneal (n = 6). Os valores são a média ± erro padrão (barras de erro). Análise de variação(ANOVA) foi empregado para investigar as diferenças entre os grupos. Se a ANOVA detectou significância estatística, o teste de Tukey foi realizado como uma análise post hoc para comparar os meios de dois grupos diferentes. As diferenças com um valor de p <0,05 foram consideradas significativas. Abreviações: qRT-PCR, reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real quantitativa; MiRNAs, microRNAs; NS, não significativo; *, P <0,05. Esta figura foi modificada de Morishita et al. 8 (com permissão). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, miRNAs na membrana peritoneal de ratos foram purificados com sucesso e detectados usando qRT-PCR. A confiabilidade da análise de dados de qRT-PCR depende da qualidade dos miARN purificados. Portanto, a pureza dos miRNAs pode ser verificada antes da qRT-PCR pela proporção de absorvência a 260 nm para a de 280 nm, que pode ser medida usando um espectrofotômetro. Quando a amplificação significativa do miARN não pode ser obtida usando qRT-PCR, a concentração de ADNc de molde pode ser aumentada. A concentração de cada iniciador específico de miARN também pode ser aumentada.
Existem vários métodos alternativos para determinar o nível de expressão de miARN, incluindo microarray, Northern blot e teste de proteção de ribonuclease. QRT-PCR é um procedimento sensível e de alto rendimento que requer uma quantidade mínima de amostra em comparação com o ensaio de proteção de Northern blot ou ribonuclease. Microarrays permitem a investigação do exp.Ressurgir de vários miRNAs simultaneamente, e os dados geralmente mostram uma forte correlação com os dados obtidos por qRT-PCR 17 ; No entanto, nenhum consenso foi alcançado em relação a uma metodologia que pode confirmar a validade das comparações de dados de microarrays entre grupos de pesquisa 18 .
Este protocolo possui as seguintes limitações. Primeiro, a validação da detecção de miARN por este protocolo não foi verificada em outros órgãos, como fígado, pulmão e rim. Em segundo lugar, também não foi verificado em outros animais experimentais, incluindo o mouse, o hamster, o cão e o porco. A plataforma deste protocolo para a purificação de miRNAs utilizando uma coluna de rotação de biopolímero e uma coluna de rotação à base de sílica e a detecção de miARN usando qRT-PCR foi relatada como capaz de purificar ARN de alta qualidade a partir de tecidos e Mostra alta precisão e sensibilidade para a detecção da expressão de miARN 10, 11 . Também mostramos que a detecção da expressão de miARN na membrana peritoneal de ratos pode ser conduzida com sucesso usando este protocolo. Este protocolo pode ser usado para estudos que investigam o perfil da expressão de miARN na membrana peritoneal de ratos em uma ampla gama de condições patológicas. Além disso, muitas amostras podem ser tratadas em conjunto usando este protocolo porque envolve um processo simples. Portanto, este protocolo é útil para estudos que requerem análise do perfil de expressão de muitos miARNs em várias condições patológicas da membrana peritoneal.
Vários pontos críticos devem ser mantidos em mente ao seguir este protocolo. Em primeiro lugar, as amostras contendo RNA purificado devem ser colocadas no gelo para evitar a degradação. Além disso, o passo de homogeneização deve ser realizado em gelo para proteger RNAs da degradação do calor. Além disso, as amostras de membranas peritoneais devem ser adequadamente homogeneizadas até ter coCompletamente dissolvido no reagente de lise, e recomenda-se o uso de uma trituradora de coluna para maior homogeneização porque as amostras de membranas peritoneais contêm tecido conjuntivo substancial que é resistente à dissolução por homogeneização. Em segundo lugar, a estabilidade do nível de expressão do miNrAR de controle endógeno deve ser verificada em toda a configuração experimental em qRT-PCR. Isso é necessário porque várias condições patológicas em que esse procedimento pode ser usado podem afetar os níveis de expressão dos miARN de controle endógeno, o que pode comprometer os resultados.
Em conclusão, descrevemos um protocolo para a purificação e detecção da expressão de microARN na membrana peritoneal de ratos usando qRT-PCR.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Miyako Shigeta por seu excelente suporte técnico. Este trabalho foi parcialmente apoiado por JSPS KAKENHI (número de concessão 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N.
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
