Détection de l'expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la détection de l'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase en transcription inverse quantitative en temps réel. Cette méthode est appropriée pour étudier le profil d'expression de microARN dans la membrane péritonéale de rat dans plusieurs états pathologiques.
Abstract
Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression de l'ARN messager après la transcription. Le profil d'expression des miARN a été étudié dans divers organes et tissus chez le rat. Cependant, les méthodes standard pour la purification des miARN et la détection de leur expression dans la membrane péritonéale de rat n'ont pas été bien établies. Nous avons développé une méthode efficace et fiable pour purifier et quantifier les miARN en utilisant une réaction quantitative en chaîne à la polymérase de transcription inverse en temps réel (qRT-PCR) dans une membrane péritonéale de rat. Ce protocole comporte quatre étapes: 1) purification de l'échantillon de membrane péritonéale; 2) purification de l'ARN total, y compris le miARN provenant de l'échantillon de membrane péritonéale; 3) transcription inverse du miRNA pour produire de l'ADNc; Et 4) qRT-PCR pour détecter l'expression de l'ARNm. En utilisant ce protocole, nous avons déterminé avec succès que l'expression de six miARN (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 et miRNA-34a-5p) augmentaientDe manière significative dans la membrane péritonéale d'un modèle de fibrose péritonéale de rat par rapport à ceux des groupes témoins. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le profil de l'expression de l'ARNm dans la membrane péritonéale des rats dans de nombreux états pathologiques.
Introduction
Les microARN (ARNm) sont des ARN courts et non codants qui post-transcriptionnellement régulent l'expression de l'ARN messager (ARNm) 1 . Les changements dans l'expression des miARN régulent l'expression de nombreux ARNm qui jouent des rôles essentiels dans diverses conditions pathologiques, y compris le cancer, l'inflammation, les troubles métaboliques et la fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Par conséquent, les miARN possèdent du potentiel comme nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Le profil d'expression des miARN a été déterminé en plusieurs ratsOrganes et tissus, y compris le foie, le cœur, les poumons et les reins 9 . Cependant, les méthodes standard pour la purification et la détection des miARN dans la membrane péritonéale de rat n'ont pas été bien établies.
L'objectif global de ce protocole est de purifier avec succès et de détecter les miARN dans la membrane péritonéale du rat. Tout d'abord, l'échantillon de membrane péritonéale a été homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur de verre, suivi d'une exposition à un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de spin de microcentrifugeuse 10 . Ensuite, l'ARN total comprenant le miARN a été purifié à partir de l'échantillon de membrane péritonéale en utilisant une colonne de spin à base de silice 10 . Ensuite, l'ADNc a été synthétisé à partir de l'ARN total purifié en utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT 11 . Enfin, l'expression de miRNA a été déterminée par qRT-PCR en utilisant un colorant intercalaire 11 . La logique de ce protocole est bSur les études antérieures qui ont montré une purification et une détection significatives du miARN dans les tissus par un procédé simple 8 , 10 , 11 . Il a été rapporté que l'utilisation d'un système de déchiquetage de biopolymères dans une colonne de spin de microcentrifugeuse et une colonne de spin à base de silice peut purifier l'ARN total de haute qualité des tissus 10 . Le procédé de synthèse d'ADNc à partir d'ARN total purifié utilisant la transcriptase inverse, la poly (A) polymérase et l'amorce oligo-dT, et la méthode de détection de l'expression de l'IRAR par qRT-PCR utilisant un colorant intercalaire dans ce protocole ont été signalés pour montrer une grande précision et Sensibilité 11 . De plus, il s'agit d'un processus simple qui permet d'économiser du temps et empêche toute erreur technique. Par conséquent, ce protocole est utile dans les études nécessitant une détection très précise et sensible du miARN dans la membrane péritonéale des rats dans un large éventail de pathologies.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant le protocole présenté dans ce manuscrit, les miARN dans la membrane péritonéale de rat ont été purifiés avec succès et ont été détectés à l'aide de la PCR qRT. La fiabilité de l'analyse des données qRT-PCR dépend de la qualité des miARN purifiés. Par conséquent, la pureté des miRNAs peut être vérifiée avant qRT-PCR par le rapport absorbance à 260 nm à celui à 280 nm, qui peut être mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre. Lorsque l'amplification significative …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous souhaitons remercier Miyako Shigeta pour son excellent soutien technique. Ce travail a été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI (numéro de subvention 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data–is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
