定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出
Summary
ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。
Abstract
マイクロRNA（miRNA）は、転写後にメッセンジャーRNAの発現を調節する小さな非コードRNAです。 miRNA発現プロファイルは、ラットの様々な器官および組織において研究されている。しかしながら、miRNAの精製およびラット腹膜におけるそれらの発現の検出のための標準的な方法は十分に確立されていない。我々は、ラット腹膜における定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を用いて、miRNAを精製および定量するための効果的かつ信頼できる方法を開発した。このプロトコルは、4つのステップからなる：1）腹膜試料の精製; 2）腹膜試料からのmiRNAを含む全RNAの精製; 3）cDNAを産生するためのmiRNAの逆転写;および4）miRNA発現を検出するためのqRT-PCR。このプロトコールを用いて、6つのmiRNA（miRNA-142-3p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-223-3p、miRNA-327、およびmiRNA-34a-5p）の発現が増加したラット腹膜線維症モデルの腹膜が対照群に比べて有意に高かった。このプロトコルは、多くの病的状態におけるラットの腹膜におけるmiRNA発現のプロファイルを研究するために使用することができる。
Introduction
マイクロRNA（miRNA）は、メッセンジャーRNA（mRNA）発現を転写後調節する短い非コーディングRNAです。 miRNAの発現の変化は、癌、炎症、代謝障害、および線維症2,3,4,5,6,7,8を含む様々な病理学的状態において重要な役割を果たす多くのmRNAの発現を調節する。したがって、miRNAは、新規バイオマーカーおよび治療標的2,3,4,5,6,7,8として潜在的可能性を有する。 miRNA発現プロファイルは、様々なラットにおいて決定されている肝臓、心臓、肺、および腎臓を含む器官および組織9 。しかしながら、ラット腹膜におけるmiRNAの精製および検出のための標準的方法は十分に確立されていない。
このプロトコールの全体的な目標は、ラット腹膜中のmiRNAを首尾よく精製および検出することである。最初に、腹膜試料をガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、続いて微量遠心分離機スピンカラム10内のバイオポリマー – 細断システムに曝露した。次に、シリカ膜を用いたスピンカラム10を用いて、腹膜試料からmiRNAを含む全RNAを精製した。次に、逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、oligo-dTプライマー11を用いて精製トータルRNAからcDNAを合成した。最後に、挿入色素11を用いてqRT-PCRによりmiRNAの発現を決定した。このプロトコルの理論的根拠はbこれまでの研究では、単純なプロセスでmiRNAの組織内での有意な精製および検出が示された8,10,11。ミクロ遠心分離スピンカラムとシリカ膜ベースのスピンカラムでのバイオポリマー粉砕システムの使用は、組織からの高品質の全RNAを精製できることが報告されています10 。逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、オリゴdTプライマーを用いた精製トータルRNAからcDNAを合成する方法、およびインターカレーティング色素を用いたqRT-PCRによるmiRNA発現の検出法は、感度11 。さらに、これは簡単なプロセスであり、時間を節約し、技術的なエラーを防止します。したがって、このプロトコルは、広範囲の病理学的状態におけるラット腹膜におけるmiRNAの高精度かつ高感度な検出を必要とする研究において有用である。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿に示されたプロトコールを用いて、ラット腹膜のmiRNAを首尾よく精製し、qRT-PCRを用いて検出した。 qRT-PCRデータ分析の信頼性は、精製されたmiRNAの品質に依存する。したがって、miRNAの純度は、分光光度計を用いて測定することができる280nmの吸光度に対する260nmの吸光度の比によって、qRT-PCRの前に調べることができる。 qRT-PCRを使用してmiRNAの有意な増幅が得られない場合、鋳型cDNAの…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
優れた技術サポートをしてくれた中田雅子に感謝します。この研究の一部は学術振興会（助成金番号25461252）によって支持された。
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
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