В Ово Электропорация в курином слуховом мозге
Summary
Слуховые нейроны головного мозга птиц и млекопитающих специализируются на быстром нейронном кодировании, фундаментальном процессе нормальных слуховых функций. Эти нейроны возникают из разных предшественников эмбрионального заднего мозга. Мы представляем методы, использующие электропорацию для экспрессии генов в заднем мозге куриных эмбрионов для изучения функции генов во время слухового развития.
Abstract
Электропорация представляет собой метод, который вводит гены, представляющие интерес, в биологически соответствующие организмы, такие как куриный эмбрион. Уже давно установлено, что куриный эмбрион является эффективной исследовательской моделью для изучения основных биологических функций развития слуховой системы. В последнее время куриный эмбрион стал особенно ценным при изучении экспрессии генов, регуляции и функции, связанных с слухом. В ovo электропорация может использоваться для лечения слуховых областей головного мозга, ответственных за высокоспециализированные слуховые функции. Эти области включают ядро цыпленка magnocellularis (NM) и ламинариум ядра (NL). Нейроны NM и NL возникают из разных предшественников ромбомеров 5 и 6 (R5 / R6). Здесь мы приводим в оо электропорации генов, кодируемых плазмидой, для изучения связанных с генами свойств в этих регионах. Мы показываем метод пространственного и временного контроля экспрессии генов, который способствует либо усилению, либо потере функционального фенотипаэс. Ориентируясь на слуховые области нервных предшественников, связанные с R5 / R6, мы показываем трансфекцию плазмид в NM и NL. Временная регуляция экспрессии генов может быть достигнута путем применения векторной системы tet-on. Это лекарственная индуцибельная процедура, которая выражает гены, представляющие интерес в присутствии доксициклина (Dox). Методика электропорации в ovo – вместе с биохимическими, фармакологическими и / или in vivo функциональными анализами – обеспечивает инновационный подход к изучению развития слухового нейрона и связанных с ним патофизиологических явлений.
Introduction
Быстрое нейронное кодирование звука имеет важное значение для обычных слуховых функций. Они включают в себя возможности локализации звука 1 , речь в шумовой дискриминации 2 и понимание других поведенческих релевантных сигналов связи. 3 . Аналогичные нейроны, расположенные в слуховом стволе мозга как у птиц, так и у млекопитающих, являются высокоспециализированными для быстрого нейронного кодирования 4 . К ним относятся ядра цыпленка magnocellularis (NM), ламинарины ядра (NL) и их аналогов млекопитающих, антевровентральное кохлеарное ядро (AVCN) и медиальная превосходная оливковая (MSO), соответственно 5 . Однако механизмы развития, регулирующие быстрое нейронное кодирование, плохо изучены в слуховом стволе мозга. Поэтому выгодно изучать специфические гены, которые ответственны за быстрое нейронное кодирование, чтобы лучше понять их выражение, регуляцию и функцию в auРазвитие.
Развивающийся куриный эмбрион является эффективным и хорошо зарекомендовавшим себя инструментом исследования для изучения основных биологических вопросов развития слуховой системы 6 , 7 . Недавние молекулярные успехи затронули эти биологические вопросы у развивающегося куриного эмбриона, выразив или сбив гены, представляющие интерес, для анализа генных функций in vivo 8 , 9 . Изучение регуляторной роли конкретных генов является значительным продвижением в понимании патологий, связанных с слуховым дефицитом. Здесь мы представляем в электроэлектронике генов, кодируемых плазмидой, в слуховой мозг мозга курицы, где происходит быстрое нейронное кодирование звука 10 . Ориентируясь на слуховые области нервных предшественников, связанные с ромбомерами 5 и 6 11 , 12 (R5 /R6), мы показываем пространственный контроль трансфекции плазмиды в NM и NL. Кроме того, мы показываем временную регуляцию выражения, применяя векторную систему tet-on. Это лекарственная индуцируемая процедура, которая выражает гены, представляющие интерес, в присутствии доксициклина (Dox) 8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
В ovo электропорация представляет собой метод выражения или сбивания генов, представляющих интерес, для анализа функции гена vivo 8 , 9 . В курином эмбрионе это инновационный метод для экспрессии генов, кодированных плазмидой, в разные области слухо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить доктора. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria и Mrs. Ximena Optiz-Araya за начальную помощь в установлении протокола и предоставлении плазмид. Эта работа была поддержана грантом NJH / NIDCD DC013841 (JTS).
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).
