在奥运电击鸡听觉脑干中
Summary
鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门用于快速神经编码，这是正常听力功能的基本过程。这些神经元来自胚胎后脑的不同前体。我们提出利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因以研究听觉发育过程中的基因功能。
Abstract
电穿孔是将感兴趣的基因引入生物相关生物体如鸡胚的方法。长期以来，鸡胚是研究听觉系统发育基本生物学功能的有效研究模式。最近，鸡胚在研究与听力相关的基因表达，调节和功能方面已经变得特别有价值。 在ovo电穿孔可用于瞄准听觉脑干区域负责高度专业化的听觉功能。这些区域包括鸡核细胞（NM）和核层（NL）。 NM和NL神经元来自菱形体5和6的不同前体（R5 / R6）。在这里，我们介绍质粒编码基因的ovo电穿孔研究这些区域的基因相关性质。我们显示一种促进功能表型增益或丧失的基因表达空间和时间控制的方法ES。通过靶向与R5 / R6相关的听觉神经祖细胞区域，我们显示在NM和NL中的质粒转染。通过采用tet-on载体系统可以实现基因表达的时间调控。这是在多西环素（Dox）存在下表达感兴趣的基因的药物诱导性程序。 卵内电穿孔技术 – 与生物化学，药理学和/或体内功能测定一起提供了一种创新的方法来研究听觉神经元发育和相关的病理生理现象。
Introduction
声音的快速神经编码对于正常的听觉功能至关重要。这些包括声音定位能力1 ，噪音识别2中的语音，以及其他与行为相关的通信信号3的理解。鸟类和哺乳动物的听觉脑干中的类似神经元是高度专门用于快速神经编码的。其中包括鸡核细胞核（NM），核心层流（NL）及其哺乳动物类似物，前内耳蜗核（AVCN）和内侧上橄榄（MSO） 5 。然而，在听觉脑干中，调节快速神经编码的发育机制知之甚少。因此，研究负责快速神经编码的具体基因是为了更好地了解其在au中的表达，调控和功能是有利的发展。
发展中的鸡胚是研究听觉系统发展基础生物学问题的有效和成熟的研究工具。最近的分子进展已经在发展中的鸡胚中通过表达或敲低感兴趣的基因来解决这些生物学问题，以分析体内基因功能8,9 。研究特定基因的调节作用是理解与听觉缺陷相关的病理学的重大进步。在这里，我们将质子编码基因的ovo电穿孔进入鸡听觉脑干，其中声音的快速神经编码发生10 。通过靶向与菱形体5和6相关的听觉神经祖细胞区域11,12（R5 /R6），我们显示了NM和NL中质粒转染的空间控制。此外，我们通过采用tet-on向量系统显示表达的时间调节。这是在多西环素（Dox） 8存在下表达感兴趣的基因的药物诱导性程序。
Protocol
Representative Results
Discussion
ovo电穿孔是一种表达或敲低感兴趣的基因以分析体内基因功能的方法8,9 。在鸡胚中，将质粒编码的基因表达到不同的听觉脑干区域中是一种创新的方法。为了确保最佳表达，需要几个关键步骤。首先，只注射其囊肿清晰可见的胚胎。如果卵巢不可见，则胚胎不能在电穿孔的正确发育阶段。第二，较小的移液管尖端使得更容易穿透神经管并导致更少的组织损伤。然?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Drs。 Leslayann Schecterson，Yuan Wang，Andres Barria和Ximena Optiz-Araya太太，为协议设置和提供质粒提供初步帮助。这项工作得到NIH / NIDCD授权DC013841（JTS）的支持。
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).
