Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha
Summary
Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.
Abstract
A eletroporação é um método que introduz genes de interesse em organismos biologicamente relevantes como o embrião de frango. Está estabelecido há muito tempo que o embrião de frango é um modelo de pesquisa eficaz para estudar as funções biológicas básicas do desenvolvimento do sistema auditivo. Mais recentemente, o embrião de frango tornou-se particularmente valioso no estudo da expressão gênica, regulação e função associada à audição. A eletroporação no ovo pode ser usada para direcionar as regiões auditivas do tronco encefálico responsáveis por funções auditivas altamente especializadas. Estas regiões incluem o núcleo de galinha magnocellularis (NM) e o núcleo laminaris (NL). Os neurônios NM e NL surgem de precursores distintos de rhombomeres 5 e 6 (R5 / R6). Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos para estudar propriedades relacionadas a genes nessas regiões. Mostramos um método para o controle espacial e temporal da expressão gênica que promove o ganho ou a perda de fenótipo funcionalEs. Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com R5 / R6, mostramos transfecção plasmídica em NM e NL. A regulação temporal da expressão gênica pode ser conseguida através da adoção de um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox). A técnica de eletroporação in ovo – juntamente com ensaios funcionais bioquímicos, farmacológicos e in vivo – fornece uma abordagem inovadora para estudar o desenvolvimento de neurônios auditivos e fenômenos fisiopatológicos associados.
Introduction
A codificação neural rápida do som é essencial para funções auditivas normais. Estas incluem habilidades de localização de som 1 , fala na discriminação de ruído 2 e a compreensão de outros sinais de comunicação relevantes ao comportamento 3 . Os neurônios análogos localizados no tronco encefálico auditivo de aves e mamíferos são altamente especializados para codificação neural rápida 4 . Estes incluem o núcleo de galinha magnocellular (NM), o núcleo laminaris (NL) e seus análogos de mamíferos, o núcleo coclear anteroventral (AVCN) e a azeitona mediana superior (MSO), respectivamente 5 . No entanto, os mecanismos de desenvolvimento que regulam a codificação neural rápida são mal compreendidos no tronco encefálico auditivo. Portanto, é vantajoso estudar genes específicos que são responsáveis pela codificação neural rápida, a fim de melhor compreender a sua expressão, regulação e função no auDesenvolvimento de distritos.
O embrião de frango em desenvolvimento é uma ferramenta de pesquisa eficaz e bem estabelecida para estudar questões biológicas básicas de desenvolvimento do sistema auditivo 6 , 7 . Avanços moleculares recentes abordaram essas questões biológicas no embrião de frango em desenvolvimento, expressando ou derrubando genes de interesse para analisar a função de genes in vivo 8 , 9 . Investigar o papel regulador de genes específicos é um avanço significativo na compreensão de patologias associadas aos déficits auditivos. Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos no tronco encefálico de frango onde ocorre uma rápida codificação neural de som 10 . Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com os fômulos 5 e 6 11 , 12 (R5 /R6), mostramos o controle espacial da transfecção do plasmídeo em NM e NL. Além disso, mostramos a regulação temporal da expressão adotando um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox) 8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
A electroporação in ovo é um método para expressar ou derrubar genes de interesse para analisar a função de genes in vivo 8 , 9 . No embrião de frango, é um método inovador para expressar genes codificados por plasmídeos em diferentes regiões do tronco encefálico 8 . Para garantir a expressão ideal, são necessárias várias etapas críticas. Em primeiro lugar, apenas injete embriões cujos otocisto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e Sra. Ximena Optiz-Araya para assistência inicial com configuração do protocolo e para fornecer plasmídeos. Este trabalho foi suportado pela concessão NIH / NIDCD DC013841 (JTS).
Materials
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3-16.1° C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 37.8° C (100° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
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