Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der<em> N.</em<sup> 6</sup> -threonylcarbamoyladenosin TcdA-Funktion
Summary
Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt.
Abstract
Wir zeigen Methoden zur Expression und Reinigung von tRNA (UUU) in Escherichia coli und die Analyse durch Gelretardierungsassays der Bindung von tRNA (UUU) an TcdA, eine N 6 -Dreonylcarbamoyladenosin (t 6 A) Dehydratase, die das Threonylcarbamoyl cyclisiert Seitenkette an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) von tRNAs an cyclische t 6 A (ct 6 A) gebunden. Die Transkription des für tRNA (UUU) kodierenden synthetischen Gens wird in E. coli mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und die tRNA enthaltenden Zellen werden nach der Induktion von 24 h geerntet. Die RNA-Fraktion wird unter Verwendung des Säurephenol-Extraktionsverfahrens gereinigt. Die reine tRNA wird durch eine Gelfiltrationschromatographie erhalten, die die kleineren tRNA-Moleküle effizient von größeren intakten oder fragmentierten Nukleinsäuren trennt. Um die TcdA-Bindung an tRNA (UUU) zu analysieren, wird TcdA mit tRNA (UUU) gemischt und auf einem nativen Agarosegel bei 4 ° C abgetrennt.Die freie tRNA (UUU) wandert schneller, während die TcdA-tRNA (UUU) -Komplexe einer Mobilitätsverzögerung unterliegen, die bei der Färbung des Gels beobachtet werden kann. Wir zeigen, dass TcdA ein tRNA (UUU) -Bindungsenzym ist. Dieser Gel-Retardierungs-Assay kann verwendet werden, um TcdA-Mutanten und die Wirkungen von Additiven und anderen Proteinen auf die Bindung zu untersuchen.
Introduction
Der Gel-Retardierungs-Assay 1 (auch bekannt als elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungs-Assay, EMSA) ist ein elektrophoretisches Verfahren zur Untersuchung und Charakterisierung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Es erlaubt die Analyse von Protein-DNA sowie Protein-RNA-Wechselwirkungen und insbesondere Wechselwirkungen zwischen tRNA und tRNA-bindenden Proteinen unter Verwendung von entweder gereinigten Komponenten oder komplexen Mischungen von Proteinen ( zB Zelllysaten) oder Nukleinsäuren ( zB tRNA Pools). Wir haben Gel-Retardierungs-Assays zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen gereinigter tRNA (UUU) und TcdA, einer N 6- Threonylcarbamoyladenosin (t 6 A) -Dehydratase, die die an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) gebundene Threonylcarbamoyl-Seitenkette cyclisiert, Von tRNAs zu cyclischen t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ist auch bekannt als CsdL 3 ,F "> 4. Das tcdA / csdL- Gen bildet mit den csdA- und csdE- Genen 5 einen Cluster, der die Cystein-Desulfurase und den Schwefelakzeptor des Cysteinsulfinase-Desulfinats (CSD-Systems) codiert und die TcdA-Funktion in vivo 3 aufrechterhalten muss.
Der Grundgedanke der Gel-Retardierungs-Assays besteht darin, dass während der freien Nukleinsäuremoleküle aufgrund ihrer großen negativen Ladung schnell an die Vorderseite von Acrylamid- oder Agarosegelen wandern, wird die elektrophoretische Beweglichkeit von Proteinkomplexen derselben Nukleinsäuren drastisch reduziert. Die Verminderung der Mobilität wird als "Verschiebung" in den Nukleinsäure-Protein-Komplexen visualisiert, die als diskrete Banden aufgelöst werden. Positiv geladene und größere Nukleinsäure-Protein-Komplex zeigen eine größere Verschiebung oder Verminderung der Mobilität auf einem Gel.
Da die Ladungsneutralisierung des Komplexes ein universelles Phänomen istFür Protein-Nukleinsäure-Komplexe kann der Gel-Retardierungs-Assay auf eine breite Palette von Komplexen und Nukleinsäure-Typen angewendet werden. Die Methode ist einfach, preiswert und kann in Laboratorien mit minimaler Ausrüstung durchgeführt werden. Es erfordert nur geringe Mengen an Proteinen und tRNA. Dies ist ein Vorteil gegenüber alternativen biophysikalischen Techniken, die in der Regel größere Probenmengen verbrauchen.
Der Gel-Retardierungs-Assay wurde weithin für die Untersuchung von Transkriptionsfaktoren verwendet. Der Assay wurde verwendet, um die Bindungskinetik, die Stärke und die Spezifität der Transkriptionsfaktoren für viele verschiedene DNA-Sequenzen zu analysieren. Es war tatsächlich auf diesem Gebiet, dass die EMSA erstmals 6 , 7 entwickelt wurde . Gel-Retardierungs-Assays mit RNA 8 , 9 , 10 , 11 und tRNA-Moleküle wurden auch in der Ribosomenforschung eingesetztUnd zu analysieren, wie wir hier tun, die Enzyme, die tRNA-Nukleoside nachtranskriptional modifizieren.
Viele verschiedene Parameter beeinflussen das Ergebnis eines Gel-Retardierungs-Assays wie Temperatur, Qualität der Protein- und tRNA-Probe und die Stärke der Bindung. Eine sorgfältige Planung und Durchführung des Experiments ist entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse der freien Nukleinsäure und der Protein-gebundenen Spezies. Hier nutzten wir das für tRNA (UUU) kodierende synthetische Gen, das in einen Expressionsvektor kloniert wurde, dessen Promotor die Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle fehlt, was zur Synthese großer Mengen der tRNA 2 führt . Dieses detaillierte Protokoll soll einen klaren Leitfaden für die Durchführung von tRNA-Gel-Retardierungsexperimenten liefern, während gemeinsame Fehler vermieden werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hierin beschriebene Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardierungs-Assay kann auf eine Anzahl von Weisen modifiziert werden. Zuerst kann der Prozentsatz der Agarose im Gel reduziert werden, um die Trennung und Visualisierung von Protein-tRNA-Komplexen signifikant größer zu machen als die hier analysierte (120 kDa). Zweitens, wenn das Zielprotein thermolabile ist, müssen zusätzliche Vorkehrungen getroffen werden, um sicherzustellen, dass die Temperatur unterhalb der maximal akzeptablen Temperatur gehalten wird, indem die…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCV ist Mitglied des CIB Intramural Programms "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Die Forschungsergebnisse, die zu diesen Ergebnissen führten, wurden vom spanischen Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 bis MCV), dem spanischen Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R und SAF2015-72961-EXP bis MCV) gefördert ), Die Regionalregierung von Madrid (S2010 / BD-2316 bis MCV) und die Europäische Kommission (Rahmenprogramm 7 (RP7)) Projekt ComplexINC (Vertrag Nr. 279039 bis MCV). Die Förderer hatten keine Rolle in Studienentwurf, Datenerfassung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
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