Протеин-тРНК-агароз-гель-запаздывающие анализы для анализа<em> N</em<sup> 6</sup> -threonylcarbamoyladenosine TcdA Функция
Summary
Протокол представлен для получения тРНК (UUU) и анализа тРНК (UUU) в комплексе с ферментом TcdA с помощью тестов запаздывания агарозного геля.
Abstract
Мы демонстрируем способы экспрессии и очистки тРНК (UUU) в Escherichia coli и анализ с помощью анализов на замедление геля связывания тРНК (UUU) с TcdA, дегидратазой N6- треонилкарбамоиладенозина (t 6 A), которая циклизует треонилкарбамоил Боковая цепь, присоединенная к A37 в петле антикодонового штока (ASL) тРНК до циклического t 6 A (ct 6 A). Транскрипцию синтетического гена, кодирующего тРНК (UUU), индуцируют в E.coli с 1 мМ изопропил-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG), а клетки, содержащие тРНК, собирают через 24 ч после индукции. Фракцию РНК очищают с использованием метода экстракции кислотным фенолом. Чистую тРНК получают гель-фильтрационной хроматографией, которая эффективно отделяет малые молекулы тРНК от более крупных интактных или фрагментированных нуклеиновых кислот. Для анализа связывания TcdA с тРНК (UUU) TcdA смешивают с тРНК (UUU) и отделяют на природном агарозном геле при 4 ° С.Свободная тРНК (UUU) мигрирует быстрее, тогда как комплексы TcdA-тРНК (UUU) подвергаются задержке подвижности, которая может наблюдаться при окрашивании геля. Мы демонстрируем, что TcdA представляет собой тРНК (UUU) -связывающий фермент. Этот анализ запаздывания геля может быть использован для изучения мутантов TcdA и эффектов добавок и других белков при связывании.
Introduction
Анализ запаздывания геля 1 (также известный как анализ сдвига электрофоретической подвижности, EMSA) представляет собой электрофоретический метод, предназначенный для изучения и характеристики взаимодействия белок-нуклеиновая кислота. Он позволяет анализировать белок-ДНК, а также взаимодействия белок-РНК и, в частности, взаимодействия между тРНК и тРНК-связывающими белками с использованием либо очищенных компонентов, либо сложных смесей белков ( например , клеточных лизатов) или нуклеиновых кислот ( например , тРНК бассейны). Мы применили анализы гель-запаздывания к изучению взаимодействия между очищенной тРНК (UUU) и TcdA, дегидратазой N6- треонилкарбамоиладенозина (t 6 A), которая циклизует боковую цепь треонилкарбамоила, присоединенную к A37 в антикодоновой штоковой петле (ASL) От тРНК до циклического t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA также известен как CsdL 3 ,F "> 4. Ген tcdA / csdL образует кластер с генами csdA и csdE 5 , которые кодируют цистеин-десульфуразу и акцептор серы системы цистеинсульфазасульфиназы (CSD) и требуется для поддержания функции TcdA in vivo 3 .
Обоснованием анализа запаздывания геля является то, что, хотя свободные молекулы нуклеиновой кислоты быстро мигрируют к фронту акриламидных или агарозных гелей из-за их большого отрицательного заряда, электрофоретическая подвижность белковых комплексов тех же нуклеиновых кислот резко снижается. Снижение подвижности визуализируется как «сдвиг» в комплексах нуклеиновых кислот и белков, которые разрешаются в виде дискретных полос. Положительно заряженный и более крупный нуклеиново-кислотно-белковый комплекс проявляет больший сдвиг или снижение подвижности на геле.
Поскольку нейтрализация заряда комплекса является универсальным явлениемДля комплексов белок-нуклеиновая кислота анализ запаздывания геля может быть применен к широкому спектру комплексов и типов нуклеиновых кислот. Метод прост, недорог и может проводиться в лабораториях с минимальным оборудованием. Это требует лишь небольшого количества белков и тРНК. Это преимущество перед альтернативными биофизическими методами, которые обычно потребляют большее количество образца.
Анализ запаздывания геля широко использовался для изучения факторов транскрипции. Анализ был использован для анализа кинетики связывания, прочности и специфичности факторов транскрипции для многих различных последовательностей ДНК. Именно в этой области EMSA был впервые разработан 6 , 7 . Анализы запаздывания геля с молекулами РНК 8 , 9 , 10 , 11 и тРНК также использовались в исследованиях рибосомИ проанализировать, как мы здесь делаем, ферменты, которые после транскрипции изменяют нуклеозиды тРНК.
Многие результаты влияют на результат анализа запаздывания геля, такого как температура, качество белка и тРНК, а также прочность связывания. Тщательное планирование и выполнение эксперимента имеет решающее значение для интерпретации результатов свободной нуклеиновой кислоты и связанных с белком видов. Здесь мы использовали синтетический ген, кодирующий тРНК (UUU), клонированный в экспрессионный вектор, промотор которого не обладает сайтом связывания рибосом Shine-Dalgarno, что приводит к синтезу больших количеств тРНК 2 . Этот подробный протокол предназначен для предоставления четкого руководства для проведения экспериментов по замещению гена тРНК, избегая при этом распространенных ошибок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Проведенный здесь анализ запаздывания гена агарозы с белком-тРНК может быть модифицирован несколькими способами. Во-первых, процентное содержание агарозы в геле может быть уменьшено, чтобы обеспечить разделение и визуализацию комплексов белок-тРНК, значительно превышающих анализир?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCV является членом CIB Intrumural Programme «Молекулярные машины для лучшей жизни» (MACBET). Исследование, ведущее к этим результатам, получило финансирование от испанского Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 до MCV), Испанского министерства экономики и конкурентоспособности (CTQ2015-66206-C2-2-R и SAF2015-72961-EXP до MCV ), Региональное правительство Мадрида (S2010 / BD-2316 – MCV) и Европейская комиссия (Рамочная программа 7 (FP7)), проект ComplexINC (контракт № 279039 на MCV). Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
