Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l'analisi del<em> N</em<sup> 6</sup> -reonilcarbamoyladenosine TcdA Funzione
Summary
Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.
Abstract
Esistono metodi per l'espressione e la purificazione di tRNA (UUU) in Escherichia coli e l'analisi mediante test di ritardo di gel del legame di tRNA (UUU) a TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi che ciclizza il treonilcarbamoil La catena laterale attaccata ad A37 nel loop di gambo anticodon (ASL) di tRNA a ciclica t 6 A (ct 6 A). La transcrizione del gene sintetico che codifica il tRNA (UUU) è indotta in E. coli con 1 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e le cellule contenenti tRNA vengono raccolte 24 h postinduzione. La frazione RNA viene purificata usando il metodo di estrazione di fenolo acido. Il tRNA puro viene ottenuto mediante una cromatografia di filtrazione a gel che effettua la separazione efficiente delle molecole di tRNA di piccole dimensioni dai più grandi acidi nucleici intatti o frammentati. Per analizzare il legame TcdA a tRNA (UUU), TcdA viene mescolato con tRNA (UUU) e separato su un gel agarosico nativo a 4 ° C.Il tRNA libero (UUU) migra più velocemente, mentre i complessi TcdA-tRNA (UUU) subiscono un ritardo di mobilità che può essere osservato durante la colorazione del gel. Abbiamo dimostrato che TcdA è un enzima tRNA (UUU) -binding. Questo test di ritardo di gel può essere utilizzato per studiare mutanti TcdA e gli effetti degli additivi e di altre proteine sul legame.
Introduction
Il saggio di ritardo di gel 1 (noto anche come test di spostamento di mobilità elettroforetica, EMSA) è un metodo elettroforetico progettato per studiare e caratterizzare le interazioni proteiche-acido nucleico. Permette di analizzare le proteine-DNA e le interazioni proteine-RNA e in particolare le interazioni tra tRNA e proteine leganti tRNA, utilizzando componenti purificati o miscele complesse di proteine ( ad es. , Lisati cellulari) o acidi nucleici ( ad esempio tRNA piscine). Abbiamo applicato saggi di retardazione del gel allo studio dell'interazione tra tRNA purificato (UUU) e TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi, che ciclizza la catena laterale di treonilcarbamoil attaccata ad A37 nel ciclo anticodonale (ASL) Di tRNA a ciclica t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA è anche conosciuto come CsdL 3 ,F "> 4. Il gene tcdA / csdL forma un cluster con i geni 5 e 5 che codificano la cisteina desulfurasi e l'acquirente dello zolfo del sistema cisina sulfinasi desulfinato (CSD) ed è richiesto per sostenere la funzione TcdA in vivo 3 .
La ragione dietro i test di retardazione del gel è che, mentre le molecole di acido nucleico libere migrano rapidamente alla parte anteriore di acrilammide o gel agarosio in virtù della loro grande carica negativa, la mobilità elettroforetica dei complessi proteici degli stessi acidi nucleici è drasticamente ridotta. La riduzione della mobilità è visualizzata come un "spostamento" nei complessi proteici dell'acido nucleico, che risolvono come bande discrete. Il complesso proteico acido nucleico caricato e maggiormente mostrato mostra un maggiore spostamento o riduzione della mobilità su un gel.
Poiché la neutralizzazione del carico del complesso è un fenomeno universalePer i complessi di acido nucleico proteico, il saggio di retardazione del gel può essere applicato ad una vasta gamma di complessi e tipi di acido nucleico. Il metodo è semplice, poco costoso e può essere condotto in laboratori con attrezzature minime. Richiede solo piccole quantità di proteine e tRNA. Questo è un vantaggio rispetto alle tecniche biofisiche alternative, che di solito consumano grandi quantità di campioni.
Il saggio di retardazione del gel è stato ampiamente usato per lo studio dei fattori di trascrizione. Il saggio è stato utilizzato per analizzare la cinetica legante, la forza e la specificità dei fattori di trascrizione per molte sequenze di DNA diverse. Fu proprio in questo campo che l'EMSA fu per la prima volta sviluppata 6 , 7 . I test di ritardo di gel con RNA 8 , 9 , 10 , 11 e molecole di tRNA sono stati utilizzati anche nella ricerca di ribosomiE di analizzare, come facciamo qui, gli enzimi che modificano i nucleosidi del tRNA post-trascrizionale.
Molti parametri diversi influenzano il risultato di un test di ritardo di gel come la temperatura, la qualità della proteina e il campione tRNA e la forza del legame. La pianificazione e l'esecuzione attenta dell'esperimento è fondamentale per l'interpretazione dei risultati delle specie libere di acido nucleico e proteine. Qui abbiamo usato il tRNA (UUU) codificante gene sintetico clonato in un vettore di espressione il cui promotore manca del sito di legame dei ribosomi Shine-Dalgarno, portando alla sintesi di grandi quantità del tRNA 2 . Questo protocollo dettagliato è inteso a fornire una guida chiara per eseguire esperimenti di ritardo del tRNA gel evitando errori comuni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio di retardazione del gel agarosico di proteina-tRNA descritto qui può essere modificato in diversi modi. In primo luogo, la percentuale di agarosio nel gel può essere ridotta per consentire la separazione e la visualizzazione di complessi proteina-tRNA significativamente più grandi di quelli analizzati qui (120 kDa). In secondo luogo, se la proteina bersaglio è termolabile, occorre prendere ulteriori precauzioni per garantire che la temperatura sia mantenuta al di sotto della massima temperatura accettabile…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCV è membro del programma CIB Intramural "Macchine Molecolari per una migliore vita" (MACBET). La ricerca che ha portato a questi risultati è stato finanziato dall'ente spagnolo Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), dal ministero spagnolo de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP alla MCV ), Il governo regionale di Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) e la Commissione europea (Programma quadro 7 (FP7)) il progetto ComplexINC (contratto n. 279039 a MCV). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta di dati e nell'analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
