Hier beschrijven we de levering van microRNA met behulp van een recombinant adeno-associated virus serotype 9 in een muismodel van een neuromusculaire ziekte. Eenmalige perifere toediening in muizen geleid tot aanhoudende miRNA overexpressie in spieren en motorische neuronen, bieden een kans om studie miRNA functie en therapeutisch potentieel in vivo.
RNA-interferentie via de endogene miRNA pathway regelt genexpressie door het beheersen van de eiwitsynthese via post-transcriptional gene zwijgen. In de afgelopen jaren is miRNA-gemedieerde genregulatie potentiële voor behandeling van neurologische aandoeningen veroorzaakt door een giftige winst van functie mechanisme gebleken. Efficiënte levering te onderzoeken weefsels heeft echter beperkte dat de toepassing ervan. Hier hebben we een transgeen muismodel gebruikt voor spinale en bulbaire musculaire atrofie (SBMA), een neuromusculaire ziekte veroorzaakt door uitbreiding van de polyglutamine in de androgeen receptor (AR), voor het testen van gene monddood maken door een nieuw geïdentificeerde AR-targeting miRNA, miR-298. We overexpressie miR-298 met behulp van een vector van de serotype 9 recombinante adeno-associated virus (rAAV) ter vergemakkelijking van de transductie van niet-delende cellen. Een enkele staart-veneuze injectie in SBMA muizen geïnduceerde langdurige en wijdverbreide overexpressie van miR-298 in skeletspieren en motorische neuronen en resulteerde in een verbetering van de neuromusculaire fenotype bij de muizen.
MiRNAs zijn niet-coderende RNAs, 21-23 nucleotiden in lengte, die een belangrijke rol bij de regulering van de expressie van genen en controle van diverse cellulaire en metabole paden spelen. 1 genexpressie wordt voornamelijk geregeld door inducerende zwijgen of mRNA aantasting van de post-transcriptional gen. 2 MiRNAs zijn meestal complementair aan de 3′ niet-vertaalde regio (UTR) voor codering van genen, hoewel binden aan de 5′ UTR en codering van de regio’s van de doelstelling van die mRNA is ook beschreven. 3
Aangezien het huidige begrip van de rol van miRNA in de pathogenese van ziekten bij de mens groeit, wordt farmacologische modulatie van individuele miRNAs of miRNA gezinnen steeds meer een haalbare therapeutische optie. Vergeleken met andere remming RNA strategiën, miRNAs hebben veel voordelen: miRNAs minder toxisch en minder immunogeen en vanwege het kleine formaat gemakkelijk in cellen kunnen worden afgeleverd. 4 , 5 , 6 MiRNAs hebben meestal veel doelen binnen netwerken voor mobiele telefonie, daarom potentiële af-target effecten en de bezorgdheid over de veiligheid moet worden rekening gehouden, samen met efficiënte levering te onderzoeken weefsels.
Neuromusculaire ziekten zijn verworven of voorwaarden die spier en motorische neuronen beïnvloeden zijn overgenomen. Het richten van drugs naar de skeletspieren is een opkomende gebied van onderzoek, waar de grootste uitdaging is om wijdverspreide distributie binnen het therapeutisch venster. 7 motorische neuronen zijn moeilijker te richten, vooral omdat de drug toegang is uitgesloten door de bloed-hersenbarrière.
Cel cultuur en muis modellen van spinale en bulbaire musculaire atrofie (SBMA) werden gebruikt in deze studie. SBMA is een neuromusculaire ziekte veroorzaakt door een giftige winst van functie-mechanisme, waarin zowel de spier en de motorische neuronen worden beïnvloed. 8 , 9 SBMA (Kennedy’s ziekte; OMIM #313200) is een X-gebonden ziekte, gekenmerkt door spierzwakte en atrofie, veroorzaakt door CAG herhalen expansie in het AR-gen, dat codeert voor een uitgebreide polyglutamine tract in het AR -eiwit. 10 geen ziekte-aanpassen-behandeling is momenteel beschikbaar voor deze aandoening. De transgene muismodel gebruikt in deze studie recapituleert de kenmerken van de ziekte, met inbegrip van het geslacht specificiteit, motor-neuron pathologie en progressieve spieratrofie. 11
In deze studie, onze inspanningen gericht op het identificeren van een miRNA die rechtstreeks ontstekingsuitlokkende uitdrukking van de mutant AR transgenic en over het ontwerpen van een veilige en efficiënte wijze van levering van de miRNA aan het ruggenmerg en skeletspieren van onze muismodel van ziekte.
Hier we geïdentificeerd een relatief genfunctieonderzoek miRNA, miRNA-298 (toetreding nummer MIMAT0004901),12 om direct mutant AR expressie in SBMA modellen. Met het oog op levering van miR-298 te onderzoeken weefsels, hebben we een virale strategie, met recombinant adeno-associated virus serotype 9 (rAAV9) gebruikt. rAAV9 is geschikt voor de overschrijding van de bloed-hersenbarrière en bemiddelen op lange termijn genexpressie in niet-delende cellen, met inbegrip van neuronen. 13 eenmalige systemische toediening van AAV9-miR-298 geleid tot aanhoudende uitdrukking van de miRNA, efficiënte transductie van spieren en motorische neuronen, down-regulatie van AR expressie, en verbetering van het fenotype van de ziekte in SBMA muizen. 14 deze methode kan worden gebruikt om miRNA of antagomirs overexpressie in vivo.
Hier tonen we een zeer efficiënte en toegankelijke methode om te selecteren en te leveren via injectie van de staart een miRNA met behulp van rAAV9 als een virale vector richten skeletspieren en motorische neuronen in muizen. 14 vergeleken met andere strategieën RNAi, zijn miRNAs minder giftig en minder immunogeen. 18 bovendien hun kleine omvang maken hen geschikt voor de verpakking van de beperkte capaciteit van virale vectoren. 2 computationele algoritmen en voorspelling hulpmiddelen kunnen de identificatie van vermeende miRNA-mRNA doelen. Zodra geïdentificeerd, moeten de effecten van miRNA op doel genexpressie worden geverifieerd. Een gemeenschappelijke aanpak is om een bepaalde miRNA in vitro overexpress en detecteren streefniveau eiwit expressie met behulp van de westelijke analyse. 14 , 19
Verschillende studies hebben virale en niet-virale strategieën gebruikt voor het leveren van miRNAs. 13 hier we gebruikten adeno-associated virus (AAV) als een gen levering tool. Vergeleken met andere virale vectoren, AAV lokt lage immunogeniciteit, kan op lange termijn genenoverdracht, en heeft een breed spectrum van tropisme in delen en niet-delende cellen. 18 deze leveringsmethode ook de behoefte aan chemische wijziging die invloed kan zijn op de functionaliteit en de specificiteit van het RNA-molecuul kan omzeilen. Er zijn verschillende serotypes van AAV, die meestal worden bepaald door de samenstelling van de eiwitten Eiwitmantel. Deze serotypen verschillen in hun tropisme en transduce van verschillende celtypes. Het is noodzakelijk om te selecteren van de juiste serotype bij het overwegen van het doelweefsel is terechtgekomen. Wij hebben gekozen rAAV9, dankzij haar hoge transductie rendement in het centrale zenuwstelsel en skeletspieren na perifere administratie19,20. Deze aanpak heeft grotere transductie werkzaamheid aangetoond in neonatale dieren ten opzichte van volwassen dieren, waarschijnlijk te wijten aan verschillen in de samenstelling van de extracellulaire matrix, neuron-glia-verhouding, en de rijpheid van de bloed-hersen-barrière. 21 , 22
Een belangrijke stap in dit protocol is het ontwerp van de expressie-vector. In vergelijking met bicistronic vectoren, die worden belemmerd door lagere expressie van het tweede gen in vergelijking met het eerste gen naast de promotor, kan de dubbele promotor vector een back-to-back-configuratie levert hoge expressie van zowel de miRNA en EGFP, dus het toestaan van lokalisatie van de miRNA in muis weefsel met immunofluorescentie.
Intraveneuze injectie van AAV9 resulteerde in hoog rendement en homogene signaaltransductie in de onderzoeken weefsels, skeletspieren en motorische neuronen. Deze route van injectie maakt de toegediende dosis te bereiken van de systemische circulatie en kruis de bloed-hersenbarrière, die belangrijk is voor therapieën gericht op het centrale zenuwstelsel. Bovendien is het een niet-invasieve methode voor levering aan de CNS. MiR-298 expressie steeg in het ruggenmerg en het spier na 2-4 weken met een enkele perifere injectie op 5 weken oud. Wanneer met behulp van single-stranded genoom AAV vectoren, de DOVO -synthese van de tweede bundel van DNA goed zijn voor de vertraagde transductie. 23
Niveaus van menselijke miR-298 waren niet detecteerbaar in behandelde muizen 20 weken na eenmalige toediening, suggereren dat voor chronische ziekten, meerdere injecties verlangd worden kunnen tot een therapeutisch nut hebben. MiRNA degradatie na verloop van tijd kan echter worden beperkt wanneer een levenslang herhaalde toediening vereist is. Adaptieve immuniteit AAV vectoren kan bovendien, een andere hinderpaal voor een succesvolle gene levering vormen. 24 zo generatie van AAV vectoren die via het immuunsysteem veroorzaakte inert is cruciaal voor herhaalde toediening en het bereiken van de effecten op lange termijn met deze veelbelovende uitvoeringssysteem. 25
Een beperking op het gebruik van miRNA als een therapeutische strategie is het risico van off-target effecten. MiRNAs kunnen communiceren door middel van incomplementary basis in paren rangschikken met andere gen afschriften, vormt die een veiligheidsrisico met deze aanpak. Verbeterd ontwerpen van de RNAi sequenties, met inbegrip van gebruik van niet-canonieke miRNAs, zoals mirtrons, die het micro-processor complex omzeilen en uitgebreide veiligheid en verdraagbaarheid langetermijnstudies zijn van cruciaal belang voor het vertalen van deze strategie in een veilige en effectieve therapie. 26 , 27 , 28
De hier beschreven methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor miRNA overexpressie, maar het kan ook worden gebruikt voor de miRNA remming therapie met behulp van antagomirs.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs verklaren geen belangenconflict. Wij danken SignaGen laboratoria (Rockvile, MD, USA) voor de productie van AAV9 virus. Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NINDS, NIH. Philip R. Lee werd gesteund door fondsen van de divisie van intramurale onderzoek van NICHD. Carlo Rinaldi werd gesteund door een beurs van de Association Française contre les myopathieën (AFM).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |