Qui descriviamo la consegna del microRNA usando un virus ricombinante adeno-associato sierotipo 9 in un modello murino di una malattia neuromuscolare. Una singola somministrazione periferica nei topi ha provocato la sovraespressione di miRNA sostenuta nel muscolo e motoneuroni, offrendo l’opportunità di studio miRNA funzione e potenziale terapeutico in vivo.
Interferenza del RNA via la via di miRNA endogeni regola l’espressione genica mediante il controllo della sintesi proteica attraverso silenziamento genico post-trascrizionale. Negli ultimi anni, regolazione genica mediata da miRNA ha indicato il potenziale per il trattamento di disturbi neurologici causati da un guadagno tossico del meccanismo di funzione. Tuttavia, consegna efficiente ai tessuti dell’obiettivo ha limitato la sua applicazione. Qui abbiamo usato un modello di topo transgenico per l’atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA), una malattia neuromuscolare causato da espansione di polyglutamine nel recettore degli androgeni (AR), per testare il silenziamento genico di una nuova identificati AR-targeting miRNA, miR-298. Abbiamo sovraespresso miR-298 utilizzando un vettore di sierotipo 9 ricombinante virus adeno-associato (rAAV) per facilitare la trasduzione di cellule di divisione. Una singola iniezione di vena caudale nei topi SBMA indotta sostenuta e diffusa la sovraespressione di miR-298 in muscolo scheletrico e motoneuroni e provocato il miglioramento del fenotipo neuromuscolare nei topi.
I miRNA sono RNA non codificanti, 21-23 nucleotidi di lunghezza, che svolgono un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica e il controllo delle diverse vie metaboliche e cellulari. 1 espressione genica è regolata principalmente inducendo la degradazione di mRNA o di silenziamento genico post-trascrizionale. 2 MiRNAs sono solitamente complementari per la regione 3′ non tradotta (UTR) di geni, codificanti sebbene vincolante al 5′ UTR e codificanti del bersaglio che mRNA inoltre è stato descritto. 3
Come si espande l’attuale comprensione del ruolo dei miRNA nella patogenesi delle malattie umane, modulazione farmacologica dei singoli miRNA o famiglie di miRNA sta diventando sempre più una valida opzione terapeutica. Rispetto ad altre strategie di inibizione di RNA, i miRNA hanno molti vantaggi: Mirna sono meno tossici e meno immunogeno e può essere facilmente consegnati nelle cellule a causa delle loro piccole dimensioni. 4 , 5 , 6 Mirna in genere hanno molti obiettivi all’interno di reti cellulari, quindi potenziali effetti fuori bersaglio e problemi di sicurezza devono essere prese in considerazione, insieme efficiente consegna ai tessuti dell’obiettivo.
Malattie neuromuscolari sono acquistate o ereditato condizioni che colpiscono il muscolo e motoneuroni. Il targeting di farmaci nel muscolo scheletrico è un settore emergente della ricerca, dove la sfida principale è di raggiungere la distribuzione capillare all’interno della finestra terapeutica. 7 motoneuroni sono più difficili da impostare come destinazione, soprattutto perché accesso droga ne vieti la barriera ematoencefalica.
Modelli di mouse e di cultura cellulare di atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA) sono stati utilizzati in questo studio. SBMA è una malattia neuromuscolare causata da un guadagno tossico del meccanismo di funzione, nelle quali sono coinvolti sia il muscolo che il motoneuroni. 8 , 9 SBMA (malattia di Kennedy; OMIM #313200) è una malattia legata al X, caratterizzata da debolezza muscolare e atrofia, causato da espansione di ripetizione di CAG del gene AR, che codifica per un tratto di polyglutamine estesa nella proteina AR . 10 nessun trattamento modificante la malattia è attualmente disponibile per questo disordine. Il modello di topo transgenico utilizzato in questo studio ricapitola le caratteristiche della malattia, tra cui la specificità di genere, patologia del neurone di motore e l’atrofia muscolare progressiva. 11
In questo studio, i nostri sforzi concentrati sull’identificazione di un miRNA che direttamente dei downregulates espressione del transgene AR mutante e sulla progettazione di una modalità sicura ed efficiente di consegna del quieto al midollo spinale e del muscolo scheletrico del nostro modello murino di malattia.
Qui abbiamo identificato un miRNA relativamente atipico, miRNA-298 (numero di accessione MIMAT0004901),12 di ridurre direttamente l’espressione AR mutante in modelli SBMA. Al fine di realizzare la consegna di miR-298 ai tessuti dell’obiettivo, abbiamo usato una strategia virale, con ricombinanti virus adeno-associato sierotipo 9 (rAAV9). rAAV9 è in grado di attraversare la barriera ematoencefalica e mediare l’espressione genica a lungo termine in cellule di divisione, compresi i neuroni. 13 una singola somministrazione sistemica di AAV9-miR-298 provocato l’espressione sostenuta del quieto, trasduzione efficiente del muscolo e motoneuroni, giù-regolamento dell’espressione di AR e miglioramento del fenotipo malattia in topi SBMA. 14 questa metodologia può essere utilizzata per fornire miRNA o recentemente sovraespressione in vivo.
Qui dimostriamo una metodologia altamente efficiente e accessibile per selezionare e consegnare tramite iniezione coda un miRNA utilizzando rAAV9 come un vettore virale per target del muscolo scheletrico e motoneuroni nei topi. 14 rispetto ad altre strategie di RNAi, Mirna sono meno tossici e meno immunogeno. 18 inoltre, le loro piccole dimensioni li rendono ben adatto alla capacità limitata confezione di vettori virali. 2 gli algoritmi di calcolo e strumenti di previsione permettono l’identificazione del presunto miRNA-mRNA bersaglio. Una volta identificati, devono essere verificati gli effetti di miRNA sull’espressione del gene bersaglio. Un approccio comune è quello di iperesprimono un determinato miRNA in vitro e rilevare i livelli di espressione della proteina bersaglio mediante analisi western. 14 , 19
Vari studi hanno utilizzato strategie virali e non virali per la consegna di Mirna. 13 qui abbiamo usato virus adeno-associato (AAV) come uno strumento di consegna del gene. Rispetto ad altri vettori virali, AAV suscita bassa immunogenicità, permette il trasferimento genico a lungo termine, e ha un vasto spettro di tropismo nel dividere e cellule di divisione. 18 questo metodo di consegna può anche eludere la necessità di modificazione chimica che può influire sulla funzionalità e specificità della molecola del RNA. Ci sono diversi sierotipi di AAV, che sono principalmente determinati dalla composizione delle proteine del capside. Questi sierotipi diversi nel loro tropismo e trasducono diversi tipi di cellule. È necessario selezionare il sierotipo corretto quando si considera il tessuto bersaglio. Abbiamo scelto rAAV9, grazie alla sua efficienza di trasduzione alta nel sistema nervoso centrale e del muscolo scheletrico dopo somministrazione periferica19,20. Questo approccio ha mostrato una maggiore efficacia di trasduzione in animali neonatali rispetto ad animali adulti, probabilmente a causa di differenze nella composizione della matrice extracellulare, neurone-a-glia rapporto e maturità della barriera emato-encefalica. 21 , 22
Un passo importante in questo protocollo è il design del vettore di espressione. Rispetto ai vettori di sialophosphoprotein, che risentono della bassa espressione del gene secondo confrontato con il primo gene accanto il promotore, il vettore di promotore dual consente una configurazione back to back producendo così alta espressione dei miRNA ed EGFP, che permette la localizzazione del quieto nel tessuto del mouse dall’immunofluorescenza.
L’iniezione endovenosa di AAV9 ha provocato ad alta efficienza e trasduzione omogenea nei tessuti bersaglio, muscolo scheletrico e motoneuroni. Questa via di iniezione consente la dose somministrata di raggiungere la circolazione sistemica e attraversare la barriera del cervello, che è importante per le terapie del sistema nervoso centrale di targeting. Inoltre, è un metodo non invasivo per la consegna al SNC. Espressione di miR-298 aumentato nel midollo spinale e nel muscolo dopo 2-4 settimane con una singola iniezione periferica a 5 settimane dell’età. Quando utilizzando vettori AAV singolo filamento del genoma, la sintesi de novo del secondo filo del DNA può rappresentare per la trasduzione in ritardo. 23
Livelli di miR-298 umana erano inosservabili in topi trattati 20 settimane dopo una singola somministrazione, suggerendo che per malattie croniche, iniezioni multiple possono essere necessarie per raggiungere un beneficio terapeutico. Tuttavia, miRNA degradazione nel tempo può essere limitante quando una permanente somministrazione ripetuta è necessaria. Inoltre, immunità adattativa a vettori AAV può formare un altro ostacolo a una consegna di successo del gene. 24 così generazione di vettori AAV che sono immunologicamente inerte è cruciale per somministrazione ripetuta e il raggiungimento di effetti a lungo termine con questo promettente sistema di consegna. 25
Una limitazione sull’uso di miRNA come strategia terapeutica è il rischio di effetti fuori bersaglio. Mirna possono interagire attraverso incomplementary appaiamento con altre trascrizioni del gene, che comporta un rischio di sicurezza con questo approccio. Migliorata la progettazione delle sequenze di RNAi, compreso l’uso di Mirna non canonico, ad esempio mirtrons, che ignorare il complesso di micro-processore e vasti studi di sicurezza e la tollerabilità a lungo termine sono fondamentali prima di tradurre la strategia in una cassetta di sicurezza e terapia efficace. 26 , 27 , 28
Il metodo qui descritto è stato originariamente sviluppato per la sovraespressione di miRNA, ma può essere utilizzato anche per la terapia di inibizione di miRNA utilizzando recentemente.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. Ringraziamo SignaGen Laboratories (Rockvile, MD, USA) per la produzione di virus AAV9. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale di NINDS, NIH. Philip R. Lee è stato sostenuto dalla divisione di ricerca intramurale di NICHD. Carlo Rinaldi è stato sostenuto da una borsa di studio dall’Association Française contre les Myopathies (AFM).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |