여기는 신경 근육 학 질병 마우스 모델에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한의 배달에 설명 합니다. 쥐에서 단일 주변 관리 연구 미르 기능과 치료 가능성 비보수 있는 기회를 제공 하는 모터 신경 및 근육에 지속적인된 미르 overexpression 귀착되는.
내 생 미르 통로 통해 RNA 간섭 post-transcriptional 유전자 입을 통해 단백질 합성을 조절 하 여 유전자 발현을 통제 한다. 최근 몇 년 동안, 중재 하는 miRNA 유전자 규칙으로 기능 메커니즘의 독성 이득으로 인 한 신경 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 나타났습니다. 그러나, 대상 조직에 효율적인 배달 응용 프로그램을 제한 했다. 여기 우리 척추과 안구 근육 위축 (SBMA) 유전자 변형 마우스 모델 사용, 신경 근육 학 질병에에서 의해 발생 polyglutamine 확장 androgen 수용 체 (아칸소 주), 유전자 침묵에 의해 테스트 하는 새로 확인 된 아칸소 타겟팅 미르, 미르-298. 우리 overexpressed 미르-298 비 분할 셀의 변환 용이 하 게 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype 9 벡터를 사용 하 여. SBMA 쥐에서 단일 꼬리 정 맥 주입 미르-298 골격 근육에 모터 신경의 지속적이 고 광범위 한 overexpression를 유도 하 고 쥐에서 신경 근육 학 형의 개량 결과.
MiRNAs는 비-코딩 RNAs, 21-23 뉴클레오티드 길이, 유전자 발현의 규칙 및 다양 한 셀룰러 및 대사 경로의 제어에 중요 한 역할을. 1 유전자 발현 post-transcriptional 유전자 침묵 또는 mRNA 분해를 유도 의해 주로 통제 된다. 2 MiRNAs는 일반적으로 3′ 되지 않은 지역 (UTR) 5′ UTR에 바인딩 하지만 유전자, 코딩 및 코딩 mRNA 설명도 대상의 영역을 보완. 3
현재 인간의 질병의 병 인에서 miRNA의 역할 이해 확장, 개별 miRNAs 또는 미르 가족의 약리 변조 가능한 치료 옵션 점점 되고있다. 다른 RNA 억제 전략에 비해, miRNAs는 많은 이점이 있다: miRNAs는 적은 독성과 보다 적게 면역성 및 전달 될 수 쉽게 셀에 그들의 작은 크기 때문에. 4 , 5 , 6 MiRNAs 일반적으로 있고 셀룰러 네트워크 내의 많은 대상 따라서 잠재적인 대상 오프 효과 고려 되어야, 효율적인 배달 대상 조직에 함께 하는 데 필요한 안전 관심사.
신경 근육 학 질병 인수 하거나 근육 및 모터 신경에 영향을 주는 조건을 상속 합니다. 골격 근육에 약물을 대상으로 한 신흥 지역 연구의 주요 과제 치료 창 내에서 광범위 한 배포를 달성 하기 위해입니다. 7 모터 신경은 주로 하기 때문에 마약 사용은 혈액 뇌 장벽에 의해 배제 대상, 더 어렵습니다.
척추과 안구 근육 위축 (SBMA)의 세포 문화와 마우스 모델은이 연구에 사용 되었다. SBMA 있는 근육과 운동 신경 영향을 받는 함수 메커니즘의 독성 증가 의해 발생 하는 신경 근육 학 질병 이다. 8 , 9 SBMA (케네디의 질병; OMIM #313200)는 X 연결 된 질병, 근육의 약점에 의해 특징 및 위축, 아칸소 단백질에 확장된 polyglutamine로 인코딩하는 AR 유전자의 CAG 반복 확장으로 인 한. 10 질병 수정 치료는 현재이 장애에 대 한 합니다. 이 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스 모델이 질병, 성별 특이성, 모터 신경 병리학, 진보적인 근육 위축 등의 기능. 11
이 연구에서 우리의 노력에 초점을 맞춘 한 미르 식별을 직접 downregulates 식 돌연변이 아칸소 transgene의 및 척수에 미르의 배달 및 우리의 질병 마우스 모델의 골격 근육의 안전 하 고 효율적인 모드 설계에.
여기 우리는 비교적 새롭거나 미르, 미르-298 (승인 번호 MIMAT0004901), 직접 SBMA 모델에 돌연변이 아칸소 식을 줄이기 위해12 확인. 대상 조직에 미르-298의 납품을 달성 하기 위하여 우리는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9 (rAAV9)와 함께 바이러스 전략 사용. rAAV9는 혈액 두뇌 방 벽을 교차 하 고 신경 세포를 포함 하 여 분할 되지 않은 셀에 장기 유전자 발현을 중재 수 있습니다. 13 AAV9-미르-298의 단일 조직 행정 결과 미르, 근육 및 모터 신경의 효율적인 변환, 다운-아칸소 식의 규정과 SBMA 쥐에 있는 질병 표현 형의 개량의 지속적인된 표현. 14 미르 또는 antagomirs overexpression에서 vivo에서제공 하는이 방법을 사용할 수 있습니다.
여기 선택 골격 근육 및 모터 뉴런 쥐에서 바이러스 성 벡터로 rAAV9를 사용 하 여 미르 꼬리 주입을 통해 제공 하 고 접근 방법론을 설명 합니다. 14 다른 RNAi 전략에 비해, miRNAs는 적은 독성과 보다 적게 면역성 있습니다. 18 또한, 그들의 소형 그들 바이러스 성 벡터의 한정 된 포장 용량에 적합 확인 합니다. 2 계산 알고리즘 및 예측 도구 putative 미르 mRNA 표적 식별을 수 있습니다. 일단 확인, 대상 유전자 발현에 미르의 효과 확인 해야 합니다. 일반적인 방법은는 주어진된 미르에 생체 외에서 overexpress 서쪽 분석을 사용 하 여 대상 단백질 식 레벨을 감지 하는 것입니다. 14 , 19
다양 한 연구는 miRNAs 제공 하기 위한 바이러스 성 및 비 바이러스 성 전략을 사용 했습니다. 13 여기 우리가 사용 adeno 관련 바이러스 (AAV) 유전자 납품 공구로. 장기적인 유전자 전송을 허용 다른 바이러스 벡터에 비해, AAV elicits 낮은 immunogenicity 고 분할에 차 있는 굴곡 운동의 광범위 한 스펙트럼 및 비 분열 세포. 18 이 전달 방법 또한 기능 및 RNA 분자의 특이성에 영향을 미칠 수 있는 화학 수정에 대 한 필요를 우회할 수 있습니다. 있다 capsid 단백질의 구성에 의해 주로 결정 된다 AAV의 여러 serotypes. 이러한 serotypes과 그들의 차 있는 굴곡 운동에 다 다른 세포 유형 transduce. 그것은 대상 조직 고려할 때 올바른 serotype를 선택 해야 합니다. 우리는 rAAV9, 중앙 신 경계와 골격 근육 주변 관리19,20다음에 높은 변환 효율성으로 인해을 선택. 이 방법은 신생아 동물 세포 외 기질 성분, 신경 명과 비율 및 성숙 혈액 두뇌 방 벽의 차이로 인해 가능성이 성인 동물에 비해 큰 변환 효능을 보이고 있다. 21 , 22
이 프로토콜에서 중요 한 단계 식 벡터의 디자인입니다. 낮은 표현의 발기인 옆 첫 번째 유전자와 비교 하는 두 번째 유전자에 의해 방해는, bicistronic 벡터에 비해 듀얼 발기인 벡터 수 따라서 miRNA EGFP의 높은 식 저조한 다시 구성 면역 형광 검사 하 여 마우스 조직에는 미르의 지역화를 허용합니다.
AAV9의 정 맥 주입 고효율 및 대상 조직, 골격 근육, 그리고 모터 신경에 균질 성 변환 귀착되는. 주입의이 경로 전신 순환에 도달 하 고 교차 하는 중앙 신 경계를 대상으로 하는 치료를 위한 중요 한 뇌 혈액 장벽 관리 복용량을 수 있습니다. 또한, CNS에 배달에 대 한 비-침략 적 방법입니다. 미르-298 식 나이의 5 주에서 단일 주변 주입으로 2-4 주 후 척수와 근육에 증가 했다. 때 단일 가닥 게놈 AAV 벡터, 두 번째 DNA 가닥의 de novo 종합을 사용 하 여 지연된 변환에 대 한 계정 수 있습니다. 23
인간의 미르-298의 수준 아니었다 치료 쥐에서 감지 단일 관리, 만성 질환에 대 한 여러 주사 치료 혜택을 도달 하는 데 필요한 될 수 있습니다 그 제안 후 20 주. 그러나, 시간이 지남에 미르 저하 평생 반복된 관리 필요한 경우 제한 수 있습니다. 또한, AAV 벡터에 적응 면역 성공적인 유전자 배달에 다른 방 벽을 형성할 수 있다. 24 는 면역학 불활성 AAV 벡터의 따라서 세대 반복 행정과이 유망한 배달 시스템으로 장기 효과 달성에 결정적 이다. 25
치료 전략으로 miRNA의 사용에 제한 대상에서 효과의 위험입니다. MiRNAs는이 방식으로 안전 위험이 다른 유전자 녹취 록과 함께 incomplementary 기본 페어링 통해 상호 작용 수 있습니다. 마이크로 프로세서 복잡 한을 무시 하 고 광범위 한 장기 안전성 및 내성 연구는 중요 한 안전에이 전략을 번역 하기 전에 비 정식 miRNAs, mirtrons, 등의 사용을 포함 하 여 RNAi 시퀀스의 설계 개선 및 효과적인 치료입니다. 26 , 27 , 28
여기 설명 하는 방법을 미르 overexpression를 위해 원래 개발 되었다 그러나 그것은 또한 antagomirs를 사용 하 여 미르 억제 치료에 이용 될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 충돌의 관심을 선언합니다. 우리는 AAV9 바이러스 생산을 위한 SignaGen 연구소 (Rockvile, 메릴랜드, 미국) 감사합니다. 이 연구는 NIH NINDS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다. 필립 R. 리는 사단의 교내 연구의 NICHD에서 기금에 의해 지원 되었다. 카를로 Rinaldi 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 장학금에 의해 지원 되었다.
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |