Her beskriver vi levering av microRNA bruker en rekombinant adeno-assosiert virus serotype 9 i en musemodell av en neuromuscular sykdommen. En enkelt ekstern administrasjon i mus resulterte i vedvarende miRNA overuttrykte i muskel og motor neurons, gir en mulighet til å studere miRNA funksjon og terapeutiske potensielle i vivo.
RNA-interferens via endogene miRNA veien regulerer genuttrykk ved å kontrollere proteinsyntese gjennom post-transcriptional gene stanse. De siste årene, har miRNA-mediert genet regulering vist potensial for behandling av nevrologiske sykdommer forårsaket av en giftig gevinst funksjon mekanisme. Men har effektiv levering målet vev begrenset sin søknad. Vi brukte her en transgene musemodell for bulbar og spinal muskel atrofi (SBMA), en nevromuskulær sykdom forårsaket av polyglutamine ekspansjon i androgen reseptoren (AR), teste genet stanse ved en nylig identifisert AR målretting miRNA, miR-298. Vi overexpressed miR-298 bruker en rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) serotype 9 vektor for å lette Albin på ikke-dele celler. En enkelt halen blodåre injeksjon i SBMA mus indusert vedvarende og utbredt overuttrykte miR-298 i skjelettlidelser muskel og motor neurons og resulterte i forbedring av nevromuskulær fenotypen i mus.
MiRNAs er ikke-koding RNAs, 21-23 nukleotider i lengde, som spiller en viktig rolle i regulering av genuttrykk og kontroll av ulike mobilnettet og metabolske veier. 1 genuttrykk reguleres hovedsakelig ved å indusere post-transcriptional gene stanse eller mRNA degradering. 2 MiRNAs er vanligvis komplementære til 3 uoversatt regionen (UTR) koding gener, men binding til den 5′ UTR og koding regioner av målet mRNA har også vært beskrevet. 3
Som den nåværende forståelsen av rollene miRNA i patogenesen av menneskelige sykdommer utvides, blir stadig farmakologiske modulering av individuelle miRNAs eller miRNA familier et levedyktig terapeutisk alternativ. Sammenlignet med andre RNA hemming strategier, miRNAs har mange fordeler: miRNAs er mindre giftig og mindre immunogenic og kan lett leveres i celler på grunn av sin lille størrelse. 4 , 5 , 6 MiRNAs har vanligvis mange mål innen mobilnettverk, derfor potensielle off-målet effekter og sikkerhetsmessige hensyn må tas i betraktning, sammen med effektiv levering målet vev.
Neuromuscular sykdommen er ervervet eller arvet forhold som påvirker muskler og motor neurons. Målretting narkotika skjelettmuskulatur er en voksende område på forskning, der den største utfordringen er å oppnå utbredt distribusjon i vinduet terapeutisk. 7 Motor neurons er vanskeligere å målrette, hovedsakelig fordi narkotika tilgang er utelukket av blod-hjernebarrieren.
Celle kultur og musen modeller av bulbar og spinal muskel atrofi (SBMA) ble brukt i denne studien. SBMA er en neuromuscular sykdommen skyldes en giftig gevinst funksjon mekanisme, der både muskler og motor neurons er berørt. 8 , 9 SBMA (Kennedys sykdom; Sette OMIM #313200) er en X-tilknyttet sykdom, preget av muskelsvakhet og atrofi, forårsaket av CAG gjenta ekspansjon i AR genet, som koder et utvidet polyglutamine skrift i AR protein. 10 ingen sykdom-modifisere behandling er tilgjengelig for denne lidelsen. Transgene musemodell som brukes i denne studien viser funksjonene i sykdommen, inkludert kjønn spesifisitet, motoriske nervecellen patologi og progressiv muskelatrofi. 11
I denne studien satsingen fokusert på å identifisere en miRNA som direkte downregulates uttrykk mutant AR transgene og utforme en sikker og effektiv måte å levering av miRNA i ryggmargen og skjelettlidelser muskel av vår sykdom musemodell.
Her identifisert vi en relativt uncharacterized miRNA, miRNA-298 (tiltredelse nummer MIMAT0004901),12 direkte redusere mutant AR uttrykk i SBMA modeller. For å oppnå levering av miR-298 målet vev, brukte vi en viral strategi, med rekombinant adeno-assosiert virus serotype 9 (rAAV9). rAAV9 er i stand til krysset blod-hjernebarrieren og formidling langsiktige byggkorn under ikke-dele celler, inkludert nerveceller. 13 en enkelt systemisk administrasjon av AAV9-miR-298 resulterte i vedvarende uttrykk for miRNA, effektiv signaltransduksjon av muskel- og motor neurons, ned-regulering av AR uttrykk og forbedring av sykdom fenotypen i SBMA mus. 14 denne metoden kan brukes til å gi miRNA eller antagomirs overuttrykte i vivo.
Her viser vi en svært effektiv og tilgjengelig metode for å velge og levere via hale injeksjon en miRNA bruker rAAV9 som en viral vektor for å målrette skjelettlidelser muskel og motor neurons i mus. 14 sammenlignet med andre RNAi strategier, er miRNAs mindre giftig og mindre immunogenic. 18 i tillegg deres lille størrelsen gjør dem velegnet begrenset emballasje kapasiteten med viral vektorer. 2 beregningsformelen algoritmer og prediksjon verktøy tillate identifikasjon av antatte miRNA-mRNA mål. Når identifisert, må effekten av miRNA på målet genuttrykk bekreftes. En felles tilnærming er å overexpress en gitt miRNA i vitro og oppdage mål protein uttrykk nivå vestlige analyse. 14 , 19
Ulike studier har brukt viral og ikke-viral strategier for å levere miRNAs. 13 her vi brukte adeno-assosiert virus (AAV) som et gen leveringsverktøy. Sammenlignet med andre viral vektorer, AAV utløser lav immunogenisitet, gjør langsiktig genoverføring, og har et bredt spekter av tropism skiller og ikke-dele celler. 18 Denne leveringsmetoden kan også omgå behovet for kjemisk endring som kan påvirke funksjonalitet og spesifisitet av RNA molekylet. Det er flere serotyper av AAV, som er avhengig av sammensetningen av kapsid proteiner. Disse serotyper varierer i sine tropism og transduce forskjellige celletyper. Er det nødvendig å velge den riktige serotype når vevet. Vi valgte rAAV9, på grunn av sin høye signaltransduksjon effektivitet i sentralnervesystemet og skjelettlidelser muskel etter ekstern administrasjon19,20. Denne tilnærmingen har vist større signaltransduksjon effekt i neonatal dyr sammenlignet med voksen dyr, sannsynligvis på grunn av forskjeller i ekstracellulær matrix komposisjon, Nevron-til-glia forholdet og modenhet av blod-hjerne-barrieren. 21 , 22
Et viktig skritt i denne protokollen er utformingen av uttrykket vektoren. Sammenlignet med bicistronic vektorer, som er hemmet av lavere uttrykk av andre genet sammenlignet med første genet ved arrangøren, kan dobbelt promoter vektoren en back-to-back-konfigurasjon gir høy uttrykk for både miRNA og EGFP, dermed tillater lokalisering av miRNA i musen vev av immunofluorescence.
Intravenøs injeksjon av AAV9 resulterte i høy effektivitet og homogen signaltransduksjon i målet vev, skjelettlidelser muskel og motor neurons. Denne ruten av injeksjon tillater administrert dosen å nå systemisk sirkulasjonen og krysse hjerne blod barrieren, som er viktig for terapi målretting sentralnervesystemet. Videre er det en ikke-invasiv metode for levering til CNS. MiR-298 uttrykk økte i ryggmargen og muskel etter 2-4 uker med en enkelt ekstern injeksjon for 5 ukens av alderen. Når bruker enkelt-strandet genomet AAV vektorer, syntese de novo den andre DNA stranden kan står for den forsinkede signaltransduksjon. 23
Nivåer av menneskelig miR-298 var undetectable i behandlet mus 20 uker etter en enkelt administrasjon, antyder at for kroniske sykdommer, flere injeksjoner kan være nødvendig å nå en terapeutisk fordel. MiRNA nedverdigelsen over tid kan imidlertid begrense en livslang gjentatte administrasjon kreves. I tillegg kan adaptiv immunitet til AAV vektorer danner en barriere til en vellykket gen levering. 24 derfor generasjon AAV vektorer som immunologisk inert er avgjørende for gjentatte administrasjon og oppnå langtidseffekter med dette lovende leveringssystem. 25
En begrensning på bruk av miRNA som en terapeutisk strategi er risikoen for off-målet effekter. MiRNAs kan samhandle gjennom incomplementary base sammenkobling med andre gene transkripsjoner, som utgjør en sikkerhetsrisiko med denne tilnærmingen. Forbedret design av RNAi sekvenser, inkludert bruk av ikke-kanoniske miRNAs, som mirtrons, som omkjøringsvei mikro-prosessor komplekset og omfattende langsiktige sikkerhet og toleranse studier er kritiske før oversette denne strategien til et trygt og effektiv terapi. 26 , 27 , 28
Metoden beskrevet her ble opprinnelig utviklet for miRNA overuttrykte, men det kan også benyttes for miRNA hemming terapi bruker antagomirs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erklære noen interessekonflikt. Vi takker SignaGen Laboratories (Rockvile, MD, USA) for AAV9 virus produksjon. Denne forskningen ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av NINDS, NIH. Philip R. Lee ble støttet av midler fra delingen av Intramural forskning av NICHD. Carlo Rinaldi ble støttet av et fellesskap fra Association Française contre les Myopathies (AFM).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |