جيل من الفئران المعدلة وراثيا من خلال ميكروينجكتيون من البويضات
Summary
يستخدم حقن ميكروينجكتيون من البويضات الماوس لكل من ترانسجينيسيس الكلاسيكية ( أي التكامل العشوائي للجينات المحورة وراثيا) و كريسبر بوساطة استهداف الجينات. هذا البروتوكول يستعرض أحدث التطورات في ميكروينجكتيون، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الجودة واستراتيجيات التنميط الجيني.
Abstract
وقد ساهم استخدام الفئران المعدلة وراثيا بشكل كبير في الدراسات على كل من الفسيولوجية والمرضية في عمليات الجسم الحي . حقن برونوكلار من التعبير الحمض النووي يبني في البويضات المخصبة لا يزال الأسلوب الأكثر شيوعا لتوليد الفئران المعدلة وراثيا ل أوفيركسريسيون. مع إدخال تكنولوجيا كريسبر لاستهداف الجينات، وقد تم تمديد حقن برونوكلار في البويضات المخصبة لتوليد كل من خروج المغلوب والفئران نوكين. ويصف هذا العمل إعداد الحمض النووي للحقن وتوليد أدلة كريسبر لاستهداف الجينات، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الجودة. إجراءات التنميط الجيني المطلوبة لتحديد المؤسسين المحتملين أمر بالغ الأهمية. وترد في هذا التقرير استراتيجيات مبتكرة للتنميط الجيني تستفيد من قدرات "تعدد الإرسال" في نظام كريسبر. كما يتم تحديد الإجراءات الجراحية. معا، فإن خطوات البروتوكول تسمح لتوليد جينالفئران المعدلة إيكاليا ولإنشاء لاحق من مستعمرات الماوس لمجموعة كبيرة من مجالات البحث، بما في ذلك علم المناعة، علم الأعصاب، والسرطان، وعلم وظائف الأعضاء، والتنمية، وغيرها.
Introduction
وكانت النماذج الحيوانية، سواء في الفقاريات واللافقاريات، مفيدة لفحص الفيزيولوجيا المرضية للظروف البشرية مثل مرض الزهايمر 1 ، 2 . وهي أيضا أدوات لا تقدر بثمن للبحث عن معدلات المرض وتطوير استراتيجيات العلاج الجديدة في نهاية المطاف على أمل العلاج. على الرغم من أن كل نموذج له قيود جوهرية، واستخدام الحيوانات والنماذج النظامية بأكملها أمر حيوي للبحوث الطبية الحيوية. وذلك لأن البيئة الفسيولوجية الأيضية والمعقدة لا يمكن محاكاة تماما في زراعة الأنسجة.
حتى الآن، لا يزال الفأر أنواع الثدييات الأكثر شيوعا المستخدمة في التلاعب الجيني لأنه يتميز العديد من المزايا. يتم حفظ العمليات الفسيولوجية والجينات المرتبطة بالأمراض بشكل كبير بين الفئران والبشر. كان الفأر أول حيوان ثديي له تسلسله الكامل للجينوم (2002)، قبل سنة واحدة من الجين البشريلي (2003). وبصرف النظر عن هذه الثروة من المعلومات الوراثية، والفأر لديه قدرات تربية جيدة، دورة تنمية سريعة (6 أسابيع من الإخصاب إلى الفطام)، وحجم معقول. كل هذه المزايا، إلى جانب المؤشرات الفسيولوجية، مثل الألوان معطف متميزة (المطلوبة لاستراتيجيات عبور)، وجعل الماوس نموذجا جذابا للتلاعب الجيني. ومن الجدير بالذكر أنه في سن مبكرة جدا من علم الوراثة الحديثة، بدأ جريجور مندل العمل على الفئران قبل الانتقال إلى النباتات 3 .
وأسفرت تقنيات نقل الجينات عن توليد الفأرة المعدلة وراثيا الأولى على مدى ثلاثة عقود مضت 4 ، التي تم إنشاؤها في البداية باستخدام الولادة الفيروسية. ومع ذلك، سرعان ما أدرك الباحثون أن واحدة من التحديات الرئيسية للالترانزجينيس الماوس هو عدم القدرة على السيطرة على مصير الحمض النووي خارجي. لأن التسليم الفيروسي من الجينات المحورة في البويضات الماوس أدى إلى نسخ متعددة متكاملة بشكل عشوائي في الجينوم، و بوسيبيليتذ من إنشاء خطوط المعدلة وراثيا اللاحقة كان محدودا.
تم التغلب على أحد هذه القيود عندما غوردون وآخرون. ولدت أول خط الماوس المعدلة وراثيا بواسطة ميكروينجكتيون 5 ، 6 . بدأ هذا عصر تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، والمعلمات التي تؤثر على نتائج جلسة ميكروينجكتيون وقد درست على نطاق واسع 7 . على الرغم من أن ميكروينجكتيون لا يسمح للسيطرة على موقع التكامل من التحوير (الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى مستويات التعبير محددة لكل مؤسس الماوس)، والميزة الرئيسية لل ميكروينجكتيون برونوكلار يبقى تشكيل المحاور ( أي صفائف من نسخ متعددة من التحوير، مرتبطة في سلسلة) قبل التكامل الجيني 5 . وقد استخدمت هذه الخاصية على مر السنين لإنشاء الآلاف من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي أوفيركسريس الجين من الفائدة. ومنذ ذلك الحين، ترانسجينيسيس، والتعديل الجيني لجينوم الكائن الحي، وقد استخدم على نطاق واسع لتحديد دور الجينات واحدة في حدوث الأمراض.
تم تحقيق إنجاز رئيسي آخر في التلاعب الجينوم الماوس عندما ماريو كابيتشي تعطل بنجاح الجين واحد في الماوس، وفتح عصر الجينات استهداف 8 . ومع ذلك، ظهرت العيوب الرئيسية بسرعة من الخلايا الجذعية المستندة إلى الخلايا الجذعية المستقرة، بما في ذلك تحديات زراعة الخلايا الجذعية السرطانية، ودرجة متغير نوعا ما من الخيمرية، وطول العملية ( أي 12-18 شهرا، والحد الأدنى، للحصول على الماوس) .
في الآونة الأخيرة، ظهرت أوجه التقدم في التكنولوجيات الجديدة، مثل إندونوكليسيس المهندسة (على سبيل المثال، نوكليسيس الإصبع الزنك (زفن)، النسخ المنشط مثل نوكليسيس المستجيب (تالين)، وتجمعات منتظمة متداخلة قصيرة متداخلة قصيرة (كريسبر / Cas9)) كطرق بديلة ل وتسريع عملية استهداف الجينات في هيئة التصنيع العسكريe 9 ، 10 . يمكن حقن هذه إندونوكليس بسهولة في البويضات الماوس عن طريق ميكروينجكتيون، مما يسمح لتوليد الفئران المستهدفة الجينات في اقل من 6 أسابيع.
منذ التقرير الأول عن استخدام كريسبر لتحرير الجينوم 11 ، هذا الجهاز المناعي التكتيكي الجرثومي قد حل محل زفن و تالين بسبب العديد من المزايا، بما في ذلك سهولة التوليف والقدرة على استهداف موقع متعدد في وقت واحد (المشار إليها باسم "تعدد الإرسال "). تم استخدام كريسبر لأول مرة لاستهداف الجينات في الفئران 12 ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها على عدد لا يحصى من الأنواع، من النباتات إلى البشر 13 ، 14 . وحتى الآن، لا يوجد تقرير عن نوع واحد مقاوم لتحرير الجينوم كريسبر.
اثنين من الخطوات الرئيسية المحددة لتوليد الفئران المعدلة وراثيا هي حقن البويضات وإعادة زرعمن هذه البويضات في الإناث الحوامل الزائفة. على الرغم من أن هذه التقنية قد وصفها لنا 15 وآخرون 16 ، والتحسينات التقنية الأخيرة في علم الأجنة الماوس وتقنيات نقل الجينات ثورة في عملية توليد الفئران المعدلة وراثيا. وسيتم وصف هذه التحسينات هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة داخل البروتوكول
ومن المعروف أن توليد الفئران المعدلة وراثيا أن يكون تحديا من الناحية الفنية. ومع ذلك، فإن بروتوكول المقدمة هنا هو الأسلوب الأمثل والمبسط الذي يسمح لإتقان واستكشاف هذه التقنية في وقت قياسي. هناك خطوتان ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون موظفي مرفق الحيوانات (برك) على دعمهم المستمر. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية ومجلس البحوث الأسترالي.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
References
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s mice. Science. 354 (6314), 904-908 (2016).
- Marantz Henig, R. . The Monk in the Garden. , (2000).
- Jaenisch, R., Mintz, B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
- Carbery, I. D. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Génétique. 186 (2), 451-459 (2010).
- Sung, Y. H. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wang, H. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kang, X. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).
- Liang, P. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).
- Ittner, L. M., Götz, J. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- . Resuspension Calculator Available from: https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/ (2017)
- Auerbach, A. B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production. Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).
- Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months. Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).
- Nakagawa, Y., et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).
- Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 7, 10431 (2016).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. , (2016).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Liu, X., et al. A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling. J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).
- Ke, Y. D. Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS. Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).
- Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection. Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Zhou, Y. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).
- Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).
- Biggers, J. D., Summers, M. C. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).
- Nakagata, N. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).
- Truett, G. E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Delerue, F., Ittner, L. M. Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects. Clon. Transgen. 4, (2015).
