Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos
Summary
La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.
Abstract
El uso de ratones modificados genéticamente ha contribuido significativamente a los estudios tanto en procesos fisiológicos y patológicos in vivo . La inyección pronuclear de construcciones de expresión de ADN en oocitos fertilizados sigue siendo la técnica más comúnmente utilizada para generar ratones transgénicos para sobreexpresión. Con la introducción de la tecnología CRISPR para la orientación génica, la inyección pronuclear en ovocitos fertilizados se ha extendido a la generación de ratones knock-out y knockin. Este trabajo describe la preparación de ADN para inyección y la generación de guías CRISPR para la orientación génica, con especial énfasis en el control de calidad. Los procedimientos de genotipado necesarios para la identificación de los posibles fundadores son críticos. Se presentan aquí estrategias innovadoras de genotipado que aprovechan las capacidades de "multiplexación" de CRISPR. También se describen procedimientos quirúrgicos. Juntos, los pasos del protocolo permitirán la generación de genY para el posterior establecimiento de colonias de ratón para una plétora de campos de investigación, incluyendo inmunología, neurociencia, cáncer, fisiología, desarrollo y otros.
Introduction
Modelos animales, tanto en vertebrados e invertebrados, han sido fundamentales para examinar la fisiopatología de condiciones humanas como la enfermedad de Alzheimer 1 , 2 . También son herramientas invaluables para buscar modificadores de la enfermedad y, en última instancia, desarrollar nuevas estrategias de tratamiento con la esperanza de una cura. Aunque cada modelo tiene limitaciones intrínsecas, el uso de animales como modelos sistémicos enteros es vital para la investigación biomédica. Esto se debe a que el entorno fisiológico metabólico y complejo no puede ser completamente simulado en el cultivo de tejidos.
Hasta la fecha, el ratón sigue siendo la especie de mamífero más común utilizada para la manipulación genética, ya que presenta varias ventajas. Los procesos fisiológicos y los genes asociados con enfermedades son altamente conservados entre ratones y humanos. El ratón fue el primer mamífero que tuvo su genoma completo secuenciado (2002), un año antes del genotipo humanoMe (2003). Aparte de esta riqueza de información genética, el ratón tiene buenas capacidades de cría, un ciclo de desarrollo rápido (6 semanas desde la fertilización hasta el destete) y un tamaño razonable. Todas estas ventajas, junto con los indicadores fisiológicos, como los distintos colores de la capa (necesarios para las estrategias de cruce), convirtieron al ratón en un modelo atractivo para la manipulación genética. En particular, en la temprana edad de la genética moderna, Gregor Mendel comenzó a trabajar en ratones antes de pasar a las plantas 3 .
Técnicas de transferencia de genes resultó en la generación del primer ratón transgénico hace más de tres décadas 4 , inicialmente creado mediante la administración viral. Sin embargo, los investigadores pronto se dieron cuenta de que uno de los principales retos de la transgénesis del ratón era la incapacidad de controlar el destino del ADN exógeno. Debido a que la entrega viral de transgenes en ovocitos de ratón resultó en múltiples copias integradas al azar en el genoma, el possibilitY de establecer líneas transgénicas posteriores fue limitada.
Una de tales limitaciones fue superada cuando Gordon et al. Generó la primera línea de ratón transgénico por microinyección 5 , 6 . Esto comenzó la era de la tecnología del ADN recombinante, y los parámetros que influyen en el resultado de una sesión de microinyección han sido ampliamente estudiados [ 7] . Aunque la microinyección no permite el control sobre el sitio de integración del transgén (que eventualmente da lugar a niveles de expresión específicos para cada ratón fundador), la principal ventaja de la microinjección pronuclear sigue siendo la formación de concatemers ( es decir, matrices de múltiples copias del transgén, Vinculados en serie) antes de la integración genómica 5 . Esta característica se ha utilizado a lo largo de los años para establecer miles de líneas transgénicas de ratón que sobreexpresan un gen de interés. Desde entonces, la transgénesis, la aModificación artificial del genoma de un organismo, se ha utilizado ampliamente para identificar el papel de los genes individuales en la aparición de enfermedades.
Otro logro clave en la manipulación del genoma del ratón se alcanzó cuando Mario Capecchi con éxito interrumpido un solo gen en el ratón, abriendo la era de la orientación de genes [ 8] . Sin embargo, los inconvenientes importantes emergieron rápidamente de la orientación de genes basados en células ES, incluyendo los desafíos de cultivar células ES, el grado de quimerismo algo variable y la duración del proceso ( es decir, 12-18 meses, mínimo, para obtener el ratón) .
Recientemente, los avances en nuevas tecnologías, tales como las endonucleasas de ingeniería ( por ejemplo, las nucleasas de dedo de cinc (ZFN), las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN) y las repeticiones palindrómicas cortas intercaladas con intervalos regulares (CRISPR / Cas9) han surgido como métodos alternativos para Acelerar el proceso de orientación de genes en micrófonoE 9 , 10 . Estas endonucleasas pueden inyectarse fácilmente en ovocitos de ratón mediante microinyección, lo que permite la generación de ratones dirigidos a genes en tan sólo 6 semanas.
Desde el primer informe sobre el uso de CRISPR para la edición del genoma 11 , este sistema inmune adaptativo bacteriano ha reemplazado ZFN y TALEN debido a sus muchas ventajas, incluyendo la facilidad de síntesis y la capacidad de apuntar múltiples loci a la vez (denominado "multiplexing "). CRISPR se utilizó por primera vez para la orientación génica en ratones [ 12] y desde entonces se ha aplicado a innumerables especies, de las plantas a los seres humanos [ 13 , 14] . Hasta la fecha, no hay ningún informe de una sola especie resistente a la edición del genoma CRISPR.
Los dos pasos limitantes principales de la generación de ratones transgénicos son la inyección de ovocitos y el reimplanteDe estos ovocitos en hembras pseudo-preñadas. Aunque esta técnica ha sido descrita por nosotros 15 y otros 16 , las recientes mejoras técnicas en embriología de ratón y técnicas de transferencia de genes han revolucionado el proceso de generación de ratones genéticamente modificados. Estas mejoras se describirán en el presente documento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo
Se sabe que la generación de ratones modificados genéticamente es técnicamente difícil. Sin embargo, el protocolo presentado aquí es un método optimizado y simplificado que permite dominar y solucionar problemas de la técnica en tiempo récord. Hay dos pasos necesarios para la finalización exitosa de la técnica. En primer lugar, la síntesis de plantillas de ADN lineal (para la síntesis de sgRNAs) se puede lograr sin cloruro de magnesio (MgCl …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal de la instalación de animales (BRC) por su apoyo continuo. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Salud y de Investigación Médica y el Consejo Australiano de Investigación.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
References
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