Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten
Summary
De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.
Abstract
Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen heeft significant bijgedragen tot studies op zowel fysiologische als pathologische in vivo processen. De pronucleaire injectie van DNA-expressieconstructen in bevruchte oocyten blijft de meest gebruikte techniek om transgene muizen te genereren voor overexpressie. Met de introductie van CRISPR technologie voor gen targeting, is pronucleaire injectie in bevruchte oocyten uitgebreid tot de generatie van zowel knock-out en knockin muizen. Dit werk beschrijft de voorbereiding van DNA voor injectie en het genereren van CRISPR-gidsen voor gen targeting, met bijzondere nadruk op kwaliteitscontrole. De genotyperingsprocedures die nodig zijn voor de identificatie van potentiële oprichters zijn kritisch. Innovatieve genotyping strategieën die gebruik maken van de "multiplexing" mogelijkheden van CRISPR worden hierin gepresenteerd. Chirurgische procedures worden ook beschreven. Samen zullen de stappen van het protocol het genereren van gen mogelijk makenEtisch gemodificeerde muizen en voor de daaropvolgende vestiging van muiskolonies voor een overvloed aan onderzoeksvelden, waaronder immunologie, neurowetenschappen, kanker, fysiologie, ontwikkeling en anderen.
Introduction
Diermodellen, zowel bij gewervelde dieren als in ongewervelden, hebben bijgedragen tot het onderzoek naar de pathofysiologie van menselijke aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer 1 , 2 . Ze zijn ook waardevolle hulpmiddelen om te zoeken naar ziekteveranderende middelen en uiteindelijk nieuwe behandelstrategieën te ontwikkelen in de hoop op een genezing. Hoewel elk model intrinsieke beperkingen heeft, is het gebruik van dieren als gehele systemische modellen van vitaal belang voor biomedisch onderzoek. Dit komt doordat de metabolische en complexe fysiologische omgeving niet volledig in de weefselkweek kan worden gesimuleerd.
Tot op heden blijft de muis de meest voorkomende zoogdiersoort die wordt gebruikt voor genetische manipulatie omdat het meerdere voordelen heeft. De fysiologische processen en genen die verband houden met ziekten worden sterk bewaard tussen muizen en mensen. De muis was het eerste zoogdier om zijn volledige genoom sequenced (2002) te hebben, een jaar voor het menselijk genoMij (2003). Naast deze rijkdom genetische informatie heeft de muis goede fokcapaciteiten, een snelle ontwikkelcyclus (6 weken van bevruchting tot speen) en een redelijke omvang. Al deze voordelen, in combinatie met fysiologische indicatoren, zoals onderscheidende coat kleuren (vereist voor het oversteken van strategieën), maakte de muis een aantrekkelijk model voor genetische manipulatie. Met name in de vroege tijd van de moderne genetica begon Gregor Mendel met muizen te werken voordat ze naar planten 3 gaan .
Gene transfer technieken resulteerden in de generatie van de eerste transgene muis over drie decennia geleden 4 , oorspronkelijk gemaakt met behulp van virale levering. Echter, onderzoekers realiseerden snel dat een van de belangrijkste uitdagingen van de muis transgenese het onvermogen was om het lot van het exogene DNA te controleren. Omdat de virale afgifte van transgenen in muis-oocyten resulteerde in meerdere kopieën willekeurig geïntegreerd in het genoom, de mogelijkheidY van het opstellen van de volgende transgene lijnen was beperkt.
Een dergelijke beperking werd overwonnen toen Gordon et al. Genereerde de eerste transgene muislijn door microinjectie 5 , 6 . Dit begon het tijdperk van recombinante DNA technologie, en de parameters die het resultaat van een microinjectiesessie beïnvloeden zijn in grote mate bestudeerd 7 . Hoewel microinjectie geen controle biedt op de integratieplaats van het transgeen (dat uiteindelijk resulteert in specifieke expressieniveaus voor elke oprichtermuis), blijft het voornaamste voordeel van pronucleaire microinjectie de vorming van concatemers ( dat wil zeggen arrays van meerdere kopieën van het transgene, Gekoppeld in serie) voor genomische integratie 5 . Dit kenmerk is door de jaren heen gebruikt om duizenden transgene muislijnen te vormen die een gen van belang uitdrukken. Sindsdien is transgenese, de aRtmatige modificatie van het genoom van een organisme, is uitgebreid gebruikt om de rol van enkele genen bij het optreden van ziekten te identificeren.
Een verdere belangrijke prestatie bij het manipuleren van het muisgenoom werd bereikt toen Mario Capecchi succesvol een enkel gen in de muis ontwricht, waardoor het tijdperk van gen targeting 8 werd geopend. Echter, grote nadeel kwam snel uit ES-cel gebaseerde gen targeting, met inbegrip van de uitdagingen van het cultiveren van ES cellen, de ietwat variabele mate van chimerisme en de lengte van het proces ( dat wil zeggen 12-18 maanden, minimum, om de muis te verkrijgen) .
Onlangs zijn vooruitgang geboekt in nieuwe technologieën, zoals geanimeerde endonucleasen (bijvoorbeeld zinkvinger nucleasen (ZFN), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALEN) en clusterde regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR / Cas9)) Versnellen het proces van gen targeting in micE 9 , 10 . Deze endonucleasen kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd in muis-oocyten door microinjectie, waardoor de generatie van gen-gerichte muizen in zo weinig als 6 weken mogelijk wordt.
Sinds het eerste rapport over het gebruik van CRISPR voor genoombewerking 11 , heeft dit bacteriële adaptieve immuunsysteem ZFN en TALEN vervangen door zijn vele voordelen, waaronder het gemak van de synthese en het vermogen om meerdere loci tegelijk te richten (aangeduid als "multiplexing "). CRISPR werd voor het eerst gebruikt voor gen targeting in muizen 12 en is sindsdien toegepast op ontelbare soorten, van planten tot mensen 13 , 14 . Tot op heden is er geen rapport van een enkele soort resistent tegen CRISPR genoom bewerking.
De twee hoofdbeperkende stappen van de generatie transgene muizen zijn de injectie van oocyten en de reimplantatieVan deze oocyten in pseudo-zwangere vrouwtjes. Hoewel deze techniek is beschreven door ons 15 en anderen 16 , hebben de recente technische verbeteringen in de muisembryologie en genoverdrachtstechnieken het proces om genetisch gemodificeerde muizen te generen, omgezet. Deze verbeteringen zullen hierin beschreven worden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol
De opkomst van genetisch gemodificeerde muizen is technisch uitdagend. Het hier gepresenteerde protocol is echter een geoptimaliseerde en vereenvoudigde methode waarmee men de techniek in recordtijd kan beheersen en oplossen. Er zijn twee stappen nodig om de techniek succesvol af te ronden. Ten eerste kan de synthese van lineaire DNA templates (voor de synthese van sgRNAs) worden bereikt zonder magnesiumchloride (MgCl2). Het wordt echter sterk aanbevolen om …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het personeel van de dierenfaciliteit (BRC) voor hun lopende ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Council en de Australian Research Council.
Materials
| Micropipette 0.1-2.5 ul | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2-20 ul | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20-200 ul | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100-1000 ul | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x – Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
References
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer’s mice. Science. 354 (6314), 904-908 (2016).
- Marantz Henig, R. . The Monk in the Garden. , (2000).
- Jaenisch, R., Mintz, B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
- Carbery, I. D. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Génétique. 186 (2), 451-459 (2010).
- Sung, Y. H. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).
- Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wang, H. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kang, X. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).
- Liang, P. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).
- Ittner, L. M., Götz, J. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- . Resuspension Calculator Available from: https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/ (2017)
- Auerbach, A. B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production. Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).
- Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months. Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).
- Nakagawa, Y., et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).
- Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 7, 10431 (2016).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. , (2016).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
- Liu, X., et al. A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling. J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).
- Ke, Y. D. Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS. Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).
- Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection. Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Zhou, Y. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).
- Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).
- Biggers, J. D., Summers, M. C. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).
- Nakagata, N. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).
- Truett, G. E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
- Delerue, F., Ittner, L. M. Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects. Clon. Transgen. 4, (2015).
