Summary
이 연구는 현미경 관찰을위한 whole-mount tissue preparation에 이어 유방 지방 패드 이식을 통한 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 증식, 분화 및 혈관 형성 가능성을 평가하는 새로운 접근법을 보여줍니다. 생체 내에서 VESC의 행동을 조사하기위한 혈통 추적 전략도 제시된다.
Abstract
내피 세포 (EC)는 혈관 건축의 기본 구성 요소이며 혈관 성장과 개조를 매개하여 적절한 혈관 개발과 항상성을 보장합니다. 그러나 내피 계통의 계층 구조에 대한 연구 는 생체 내에서 의 행동을 직접적으로 평가할 수있을뿐 아니라 액세스를 얻기위한 도구가 없기 때문에 여전히 어려움을 겪고 있습니다. 이 결점을 해결하기 위해, 유방 지방 패드를 사용하여 혈관 신생을 연구하는 새로운 조직 모델이 개발되었습니다. 유선은 사춘기 및 임신을 포함하여 출생 후의 단계에서 주로 발생하며, 그 동안 견고한 상피 증식이 광범위한 혈관 재 형성을 동반합니다. 유방 지방 패드는 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공합니다. 또한 유방 지방 패드는 복강 외에도 위치하여 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가할 수있는 쉽게 접근 할 수있는 접목 사이트가됩니다. 이 작품은 또한 효율성in vivo에서 혈관 내피 줄기 세포 (VESCs)의 표적 집단을 특이 적으로 표지하기 위해 형광 리포터 마우스를 사용하는 nt 추적 접근법. 이 계통 추적 방법은 후속 조직 전체 장착 현미경과 결합하여 표적화 된 세포와 그 자손을 직접 시각화 할 수 있으며이를 통해 증식 능력을 정량화 할 수 있고 분화 약속을 운명 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방법을 사용하여 VESCs를 발현하는 양성 단백질 C 수용체 (Procr)의 개체군이 최근 여러 혈관계에서 확인되었다. Procr + VESCs는 새로운 EC와 혈관 주위 세포 모두를 일으키며, 발달, 항상성 및 상해 복구 중 혈관 신생에 적극적으로 기여합니다. 전체적으로이 원고는 VESC의 줄기 세포 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 새로운 유방 지방 패드 이식과 생체 내 혈통 추적 기술을 설명합니다.
Introduction
개발과 항상성 동안, 혈관 성장과 개조는 신실하게 기관 성장과 수리에 따라 일어납니다. 혈관 신생은 선재 혈관으로부터의 새로운 혈관 생성을 설명하며, 이러한 동적 인 혈관 변화를 중재하는 주요한 힘으로 간주된다. 각 혈관은 내피 세포 (inner cells, ECs)의 층으로 안쪽에 늘어서 있으며 혈관 건축의 기초로 보인다. 오랜 시간 동안 항상성 (homeostasis) 동안 EC pool이 보충되는 메카니즘은 여전히 명확하지 않았으며, 혈관 회전율이 성숙한 EC 증식의 결과인지 혈관 줄기 / 전구 세포 활동의 기여인지에 대한 주장이 제기되었다. 직접적인 생리 학적 증거가 없기 때문에 혈관 내피 줄기 세포 (Vascular endothelial stem cell, VESCs)의 존재와 세포 신원은 논란의 여지가있다.
줄기 세포 행동을 확인하는 데 사용되는 가장 일반적인 접근법 중 하나는 transplan추정 줄기 세포를 수령 마우스에 투여 이 방법 은 생체 내 후보 줄기 세포의 줄기 가능성을 측정합니다 . 이식은 먼저 조혈 시스템 2 의 계층 적 특징의 수립에 기여한 골수 줄기 세포 1 의 연구에 적용되었습니다. 내피 분야에서, 측면 피부 아래 피하에 삽입 된 기저막 매트릭스 ( 예 : matrigel) 플러그는 이식 된 EC의 혈관 형성 능력을 설명하기 위해 사용 된 생체 내 혈관 신생 분석 표준이었다. 3D 배양 시스템과 이식에서의 콜로니 형성을 포함한 여러 실험 방법은 잠재적 인 EC progenitor / VESC 집단을 3 , 4 , 5 , 6으로 제안했다. 그러나, 기저막 매트릭스에 내장 된 EC는 상대적으로 분리되어 있기 때문에주변 조직은 이식 된 세포의 혈관 신생 가능성을 완전히 탐색하는 데 필요한 최적의 틈새 환경을 제공하지 않습니다. 결과적으로, 매트릭스 플러그 내에 형성된 혈관은 주로 모세 혈관 유사하며 기능적으로 측정 불가능합니다.
유선은 출생 후 사춘기 및 임신 기간 동안 가장 강력한 성장을 보이며 발달합니다. 사춘기 단계에서 유방 상피는 주위의 혈관 구조물을 효과적으로 개장하는 동시에 유방 지방 패드 전체를 차지하도록 급속히 팽창합니다. 따라서 유선은 혈관 신생 연구에 훌륭한 모델입니다. 그것은 성장하는 유방 상피로부터 공간, 매트릭스 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공하며, 따라서 외인성 세포의 혈관 신생 가능성을 평가하기위한 이상적인 이식 부위이다. 또한 유방 지방 패드는 형성된 외인성 혈관이 숙주 순환 시스템과 통합되도록하여 functional 평가 및 피하 이식에 대한 이점을 나타냅니다.
시험 관내 배양 및 이식 시험은 세포 집단의 재생 특성을 조사하는 효과적인 방법이기는하지만, 세포가 원래의 서식처에서 제거됨에 따라 가소성을 자극 할 수 있으며 세포가 분리되면 변화가 유발 될 수 있음이 알려져있다 그들의 생리적 환경 7 . 그러므로 세포 내 운명의 직접적인 생체 내 증거를 얻는 것이 내피 개체군의 행동에 대한 현재의 이해를 발전시키는 핵심 접근법이다.
생체 내에서 줄기 세포의 생체 내 행동을 밝힐 수 있기 때문에 VESC의 확인과 신체 시스템의 특성 조사에 유전 학적 운명 매핑 ( 즉, 생체 내 혈통 추적)이 반드시 필요합니다. 평가했다. 계보 traci후보 VESC의 장기 지속성 ( 즉, 자가 갱신)과 기원 조직 ( 즉, 분화 효능)을위한 세포 유형을 생산할 수있는 능력에 대한 직접적인 증거를 제공한다.
이 프로토콜은 VESC의 혈관 생성 능력을 관찰하기위한 새로운 유방 지방 패드 이식 기술과 혈통 추적 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 현재 이용 가능한 분석법의 단점을 극복하고 VESC의 줄기 세포 특성을 최적으로 평가하는 새로운 방법을 제공합니다. 이러한 접근법은 병적 인 환경에서 혈관 세포 효능의 변화를 결정할뿐만 아니라 내피 집단의 행동 및 혈관 형성 특성을 평가하는 데 사용할 수있는 효율적인 도구입니다.
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Protocol
실험 절차는 승인 된 프로토콜 SIBCB-NAF-15-002-S335-003에 따라 중국 과학원 상하이 생화학 및 세포 생물학 연구소 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 마우스 유선으로부터의 VESCs의 분리
- 유선 선 수확 및 조직 소화.
- 조직 기증자로 무게가 20에서 25 g 사이 인 8 주 된 액틴 -GFP 성숙한 처녀 기자 마우스를 사용하십시오.
참고 : 기증자로부터 유래 한 세포는 GFP 발현에 의해 쉽게 추적 될 수 있습니다. - RPMI1640에 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 펜 / strep 및 25 MM HEPES로 구성된 조직 소화 기본 매체를 준비합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 혼합물을 여과하고 물로 37 ° C로 예열하고 사전 예열하십시오.
- CO 2 챔버에서 생쥐를 희생. 첫 번째 수직 피부를 만들어서 사타구니 유선의 네 번째 쌍을 해부합니다.(또는 외과 용 가위)를 사용하여 하 복부 중간 선에서 정중선 검사. 부드럽게 한쪽으로 포 using를 사용하여 사타구니의 유선을 노출 피부를 껍질. 양쪽에서 사타구니의 제 4 유방 땀샘을 얻고 가위로 6cm 페트리 접시에 잘게 자릅니다.
- 다진 조직의 총 무게를 측정하고 50 ML 튜브에 놓으십시오.
참고 : 결과 조직 뭉치가 각 조각에 대해 1mm 3 보다 작은 지 확인하십시오. 전형적인 수확량은 동물 당 약 5,000 VESC입니다.
- 다진 조직의 총 무게를 측정하고 50 ML 튜브에 놓으십시오.
- 조직 말단 1g 당 10mL의 양으로 50mL 뚜껑이 달린 원심 분리 튜브에서 소화 기질을 준비한다. 소화 완충액을 구성하는 소화 기질 10 mL 당 300 단위의 농도로 콜라게나 제 제 3 형을 첨가하십시오. 균등하게 섞어서 티슈 말에 첨가합니다.
- 수평으로 50-mL 원심 분리 튜브를 흔들 플랫폼에 놓고 속도를 100 rpm으로 설정하고 온도를 37 ° C로 설정합니다. 흔들다유방 조직 2 시간. 적절한 소화가 이루어 지도록 튜브를 20 분마다 점검하고 수동으로 흔들어주십시오.
참고 : FACS 이전의 조직 소화의 목적은 고체 조직으로부터 단일 세포 용액을 준비하는 것입니다. 따라서 소화가 끝날 때까지는 내용물이 눈에 보이는 조직 조각이없는 두꺼운 용액이어야합니다.
- 조직 기증자로 무게가 20에서 25 g 사이 인 8 주 된 액틴 -GFP 성숙한 처녀 기자 마우스를 사용하십시오.
- 단일 셀 솔루션 준비.
- 소화 후 미리 데워진 멸균 된 PBS로 50 mL 원심 분리 튜브를 충전하고 균등하게 혼합되도록 튜브를 뒤집습니다. 튜브를 200 xg에서 5 분간 원심 분리하여 세포 펠렛을 얻습니다.
- 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 풀어 튜브의 바닥을 가볍게 치십시오. 적혈구를 용해시키는 완충액 3 mL (재료 표 참조)를 첨가하고 실온 (RT)에서 조직 배양 후드에서 5 분 동안 적혈구를 제거합니다.
- 멸균 PBS 10 ML을 추가하고 균등하게 섞어 튜브 반전. 5 분 200 XG에서 원판 내용물을 원심 분리기 및 디스크상징액을 얻는다. 미리 데워진 0.05 % 트립신 3 mL를 넣고 5 분 동안 37 ℃에서 튜브를 보관하여 나머지 조직을 추가로 소화시킵니다.
- 예열 된 IMDM 3 ML을 추가하고 100 μl의 DNase I 용액을 첨가하십시오 (PBS 1 mL에 희석 한 DNase I 0.25 mg). 튜브를 37 ° C에 보관하여 DNA 필라멘트를 분해하십시오. 세포 솔루션을 얻기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직 혼합물을 전달하십시오. 효소 소화를 중화하기 위해 PBS + 5 % FBS 2 ML로 스트레이너를 두 번 씻어.
- 세포를 펠렛으로 만들기 위해 5 분 동안 200xg에서 세포 혼합물을 원심 분리하십시오. 뜨는을 삭제하고 항체 얼룩에 대한 PBS + 5 % FBS의 1 ML에 세포 펠렛을 resuspend.
- FACS 기반 Procr + VESC 격리.
- 기증자 유방 조직에서 얻은 세포 혼합물을 발표 된 일상적인 프로토콜 8 항체 염색법을 실시하십시오.
참고 : 다음 항체가 사용되었습니다 : 항 마우스혈액 계통 -FITC, 항 마우스 CD31 (PECAM1) -PECY7, 항 마우스 CD105-APC (모두 1㎍ / mL의 농도로 사용), 항 마우스 CD201 (Procr) - 비오틴 (농도 2.5 μg / mL) 및 streptavidin-v450 (0.5 μg / mL의 농도로 사용함).- 항체 염색 후 PBS + 5 % FBS로 세포를 충전하고 5 분 동안 200g에서 원심 분리합니다. 뜨는을 버리고 PBS + 5 % FBS 1 ML와 세포를 resuspend. 40 μm 셀 스트레이너로 걸러냅니다. FACS 정렬까지 얼음에 놓습니다.
- Procr + VESC를 분리하기 위해 FACS 기반 정렬을 수행하십시오.
- 염색되지 않은 샘플과 각 단색 컨트롤을 분석하여 각 색상의 전압을 결정하십시오. 자동 형광 또는 배경 염색을 피하기 위해 보정 매개 변수를 계산하십시오. 원하는 세포 집단에 대한 적절한 게이팅 및 정렬을위한 템플리트를 설정하십시오.
- FACS 정렬의 계층 구조를 설정하려면 먼저 파편을 제거합니다.모든 이벤트를 수행 한 다음 폭으로 트리거하여 이중선 또는 접착 성 세포 클러스터를 버립니다. 혈통 계통을 차단 한 다음 CD31 + 및 CD105 +를 사용하여 내피 세포 수를 정의합니다.
참고 : Procr + 세포는 FMO 대조군과 비교하여 CD31 + CD105 + EC로부터 분리되었다. 대표적인 FACS 분석 플롯이 그림 1에 나와 있습니다. FACS로 분리 된 VESC 모집단은 IMDM + 50 % FBS에 현탁시키고 추후 가공 할 때까지 얼음에 보관해야한다.
- 기증자 유방 조직에서 얻은 세포 혼합물을 발표 된 일상적인 프로토콜 8 항체 염색법을 실시하십시오.
2. 유방 팻 패드를 사용 하여 생체 내 VESC 혈관 형성 분석
- 이식을위한 주 EC를 준비하십시오.
- 10 % PBS + 5 % FBS로 FACS 정렬 세포를 탑 - 업하고 5 분 동안 200 xg에서 원심 분리하여 세포를 바닥에 내려 놓습니다.
- 액체를 조심스럽게 흡인하고, hemocytometer를 사용하여 셀 번호를 계산하고, 세포막 펠렛을 기저막 매트릭스 혼합물 (consi100 ng / mL rmVEGF 및 60 U / mL 헤파린이 보충 된 50 % 기저막 매트릭스 및 20 % FBS가 함유 된 PBS)에 15,000 세포 / 15 μL의 작업 농도에 도달하도록 하였다.
참고 : 기저막 매트릭스 혼합물은 항상 얼음 위에 보관해야합니다. - 정렬 된 세포와 계수 된 세포를 연속적으로 희석하여 1.5mL 마이크로 튜브에 필요한 입력 농도에 도달 시키십시오. 최종 주입량이 총 15μL을 초과하지 않도록하십시오. 이식시 더 나은 내용 시각화를 위해 각 튜브에 0.1 % Trypan blue를 추가하십시오. 믹스하기 위해 철저히 피펫. 사용하기 전까지 얼음에 튜브를 보관하십시오.
참고 : 성공적인 선박 생성은 최소 100 VESC로 달성 될 수 있습니다.
- 주 EC를 유방 지방 패드에 이식하십시오.
- 수술 도구와 벤치 탑을 소독하십시오. 여러 동물에서 동일한 도구를 사용하는 경우에는 비드 살균기를 사용하여 소독 할 수 있습니다.
- 3 주된 BALB / C 누드 마이크 마취귀하의 기관의 수의사와 IACUC에서 권장하는 마취 프로토콜을 사용하십시오. 수술 테이블에 등을 대고 각 마우스를 앙와위 자세로 눕습니다. 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 고정시킵니다.
- 면봉을 요오드 계 살균 용액에 담급니다. 수술 전 피부 표면을 살균하기 위해 마우스의 복부 전체를 닦으십시오.
- 마우스의 복부 피부를 잡고 포셉으로 들어 올립니다. 외과 용 메스를 사용하여 1cm 길이의 작은 절개를 만듭니다. 뒷다리를 향해 길이가 약 0.5 - 1 cm 인 두 번 자르고, 뒤집힌 Y 자형 절개를하십시오.
- 집게와 면봉을 사용하여 복부에서 피부를 부드럽게 분리하고 피부를 옆으로 핀으로 쥐의 유방을 노출시킵니다. 입체경 아래에 마우스를 놓고 배율을 2.0X로 설정합니다. 유방 지방 패드를 명확하게보고 조작 할 수 있도록 초점을 조정하십시오.
- 장소 27G 1 / 2 "needl얼음에 담아서 미리 차게하십시오. 바늘 부착 부위에 갇힌 기포를 제거하기 위해 기저막 매트릭스 혼합물이 들어있는 1 mL 주사기를 미리 준비하십시오. microcentrifuge 튜브의 뚜껑에 혼합 솔루션 15 μL를 피펫 다음 뇌관 주사기로 전체 볼륨을 대기음.
- 사타구니 림프절 앞에서 유방 지방 패드를 고정 핀셋을 사용하여 잡고 약간 쉽게 들어 올리십시오. 뚱뚱한 패드에 주사기 바늘의 약 1/4을 부드럽게 삽입하십시오.
- 일시 중지 패드에서 핀셋을 놓아 주사기 바늘을 잡고 안정시킵니다. 액체가 누출되지 않도록 천천히 용액을 주입하십시오. 바늘을 꺼낼 때 누출을 최소화하기 위해 셀 혼합물이 고형화되었는지 확인하기 위해 몇 초 동안 기다리십시오.
- 흡수성 봉합사로 피부 플랩을 닫습니다. 크기 5-0 비 반응성 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 피부 플랩을 봉합하고 외과 의사 스타일의 매듭으로 각 상을 닫습니다.ately 0.3 cm 떨어져있다. 또는 상처 스테이플로 피부를 닫으십시오.
- 회복을 위해 별도의 케이지에 운영 마우스를 배치합니다. 마취 된 마우스가 저체온증을 앓지 않도록 케이지 위에 가열 램프를 놓습니다. 케이지 바닥에 부드러운 종이와면을 놓아 쥐가 수술 후 따뜻한 상태를 유지하게하십시오.
- 모든 수령자가 완전히 깨어날 때까지 조심스럽게 마우스를 관찰하십시오. 다음 며칠 동안, 모든 동물에게 선제 적으로 수술 후 진통제를 투여하거나 시설 수의사의 지시에 따라 투여하십시오. 상처 감염이 발생하면 승인 된 동물 프로토콜에 따라 항생제를 바릅니다. 수술 상처가 상처 스테이플로 닫혀 있다면 상처가 완전히 닫힌 수술 10 일 후에 상처 클립을 제거하십시오.
3. 현미경 관찰을위한 전체 마운트 조직 준비
- 조직 수확
- 이식 후 2 - 4 주에 수혜자 BALB / c를 마취시킨다.단계 2.2.2에서와 같이, 체중 20g 당 0.12mL의 투여 량으로 2.5 % 마취제를 복강 내 주사하여 누드 마우스에게 투여 하였다.
참고 : 양성 혈관 성장은 세포 이식 후 2 - 4 주에 감지 할 수 있습니다. - 무균 PBS 50 μL에 resuspended 체중의 50 μg / 25 g의 복용량에 isolectin - 647 염료의 꼬리 정맥 주사와 수신 시스템의 순환을 라벨. 5 ~ 10 분의 쉬는 시간을 두십시오. CO 2를 사용하여 마우스를 희생한다.
- 단계 2.2.4에 따라 세포가 처음 주입 된 유방 조직의 영역을 해부합니다. 외과 용 가위를 사용하십시오. 수술 블레이드를 사용하여 6cm 페트리 접시에 대략 3 ~ 4mm 3 큐브로 조직을 자릅니다.
- 이식 후 2 - 4 주에 수혜자 BALB / c를 마취시킨다.단계 2.2.2에서와 같이, 체중 20g 당 0.12mL의 투여 량으로 2.5 % 마취제를 복강 내 주사하여 누드 마우스에게 투여 하였다.
- 조직 소화 및 항체 염색을위한 준비.
- 콜라게나 제 III가 보충 된 미리 데우는 소화 기질 (단계 1.1.2)의 10 ML로 채워진 15 ML 원심 분리기 튜브에있는 조직 조각을 소화(10 mL 당 300 U).
- 100 rpm으로 설정 한 속도와 37 ° C로 설정된 흔들어 대는 플랫폼에 수평으로 15 mL 원심 분리 튜브를 놓고 약 1 시간 동안 조직 구조를 풀고 과도한 지방 세포 조직을 제거합니다.
참고 : 지방 세포는자가 형광을 생성하여 시끄러운 형광 배경을 만들 수 있습니다. 소화가 끝나면 조직 조각은 부드럽고 흐린 모양을 가져야합니다. 최적의 소화 기간은 잘게 썬 조직 조각의 크기에 따라 다르므로 최적의 결과를 얻으려면 적절하게 조정해야합니다. 조직 vasculature는 이미 형광 태그 Isolectin로 라벨이 붙어 있기 때문에, 모든 다음 절차는 빛으로부터 보호 수행해야합니다. - 10 분 동안 실온에서 PBS로 조직 조각을 씻으십시오. 형광을 보존하기 위해 4cm PFA (pH 7.2 - 7.4)로 반쯤 채워진 6cm 페트리 접시에 조심스럽게 조각을 놓아서 전체 장착 조직을 고정시킵니다. 페트리 접시 놓기락킹 플랫폼에 놓고 RT에서 30 분 동안 조직을 부드럽게 교반한다.
주 : PFA는 발암 물질이므로주의해서 취급해야합니다. - 나머지 PFA를 제거하고 각 세척 사이에 10 분 간격으로 전체 고정 세척 버퍼 (PBS에 0.1 % 트윈)로 고정 된 조직을 세 번 씻으십시오.
- 전체 - 마운트 조직 항체 얼룩.
- 2 ML 원심 튜브에 항체 얼룩 버퍼에 기본 항체를 희석. 4에서 밤새 일차 항체와 조직을 품어 ° C.
주 : 항체로서 래트 항 -CD31 (농도 : 10㎍ / ㎖) 또는 래트 항 -VE- 카데 렐 (CD144 / Cdh5; 농도 : 2.5㎍ / ㎖)을 사용 하였다. CD31과 VE-Cadherin은 내피를 인식하는 데 사용되는 세포 표면 마커입니다. 5x 항체 염색 완충액을 500 mM 말레 산, pH 7.5로 제조하고; 750 mM NaCl; 및 0.5 % (v / v) 트윈은 PBS에 용해된다. 신선한 1x 작업 용액을 준비 할 때만 적절한 혈청 용적 (5 %)을 첨가하십시오9 . - 항체 염색 버퍼를 제거하고 10 분 간격으로 세척 버퍼로 전체 마운트 조직 세 번 씻으십시오. 락커트 플랫폼에서 4 시간 동안 또는 4 ° C에서 밤새 2 차 항체 ( 재료 표 참조) 플러스 RT에서 DAPI와 조직을 품어.
참고 : 핵을 시각화하기 위해 5 μg / mL의 최종 농도로 DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole)를 사용하십시오. - 10 분 동안 각각 3 번 세척 버퍼로 전체 마운트 조직을 씻으십시오. 80 % 글리세롤 또는 80 % 자당에서 조직 조각을 밤새 품어 더 나은 보존을 위해 조직을 탈수하십시오.
- 유리 슬라이드에 개별 조직 조각을 놓고 과도한 탈수 버퍼를 제거하십시오. 장착 매체와 조직을 덮고, coverslip을 배치하고 부드럽게 그것을 설정하는 조직을 쥐어 짜십시오.
- 공 촛점 현미경 이미지 수집을 수행하십시오. 전체 장착 유방 땀샘의 경우, NA = 1.3 오일 목표를 가진 40X를 사용하여 이미지를 획득하십시오ve. 1,024 x 1,024의 광학 섹션 해상도와 1.0 - 1.2 μm의 레이어 분리로 Z 스택의 타일 스캔을 획득합니다.
참고 : 올바른 형광 신호를 포착하려면 필터 빔 스플리터를 PMT Gain 600-800의 게인 설정으로 트리플 다이크로 익 (TD) 488/553/638로 설정해야합니다. 다음의 여기 / 방출 원을 사용해야한다 : 488/509 nm의 여기 / 방출 최대 값을 갖는 mGFP; 532/588 nm의 여기 / 방출 최대 값을 갖는 mTomato; Alexa-647, 여기 / 방출 최대 값은 594/665; 및 DAPI (350 / 470의 여기 / 방출 최대 값).
- 2 ML 원심 튜브에 항체 얼룩 버퍼에 기본 항체를 희석. 4에서 밤새 일차 항체와 조직을 품어 ° C.
4. 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 계통 추적
- 마우스 모델을 사용하여 Procr + VESC를 탐지합니다.
- Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + ( Procr CreERT2 라고 함) 노크 인 마우스를 사용하십시오.
참고 :이 마우스 모델에서는 CreERT2-IRES-tdTomato 카세트- (R26 mTmG이라 함) Rosa26 mTtomatomGFP 리포터 균주 크로스 Procr CreERT2 마우스 생체 내에서 내인성 Procr 11 +되는 EC의 운명을 추적한다. GFP 발현을 사용하여 모든 내인성 Procr + EC 및 그 자손을 확인하십시오.
- 사춘기 단계 (5 주) 동안 체중 4 mg / 25 g의 용량으로 타목시펜 용액 11 (10 mg / mL의 저장 용액을 만들기 위해 땅콩 기름 + 10 % 에탄올에 용해 된 타목시펜 10 mg을 복강 내 투여) 이전) Procr + EC의 발달 과정을 추적 할 수 있습니다.
- 3 단계에서 설명한 준비 단계에 따라 Whole-mount immunostaining으로 표지 된 세포의 클론 형성 효율을 분석합니다. 단기 (2 일) 및 연장 된 기간 (최대 10 개월). 그림 3을 참조하십시오.
- Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + ( Procr CreERT2 라고 함) 노크 인 마우스를 사용하십시오.
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Representative Results
유방 VESC 격리 :
결과 이식 분석을위한 내피 개체군을 분리하기 위해, 성숙한 (8 주령) 처녀 마우스 유선을 공여체 재료로서 수확했다. 내피 세포는 항체 - 기질 세포 분류 기술을 사용하여 분리 하였다. 8 주령의 C57BL / 6 유방 선되는 EC의 VESC 인구의 FACS 분석의 대표적인 플롯 (허가 유 등. (8)로부터 적응도)도 1에 나타내었다.
유방 뚱뚱한 패드 이식 :
유방 지방 패드는 혈관 신생 연구에 이상적인 사이트를 제공합니다. FACS- 기반 분리 후, Procr + EC를 0.5 % 기저막 매트릭스 및 0.1 % 트립 판 블루 지시약과 혼합 한 다음 트랜스 플래 인 하였다3 주된 SCID 수신자의 빈 지방 패드에 연결했다. 사춘기 동안 유방 지방 패드는 혈관 신생 환경을 만들어 유방 상피 확장과 일치하여 혈관 구조의 재구성을 촉진합니다. 그 결과, 이식 된 Procr + ECs (GFP + )는 숙주 ( 도 2B , 화살표)의 큰 혈관에 통합되고 또한 2 차 및 3 차 GFP + 혈관 가지를 형성한다 ( 도 2B , 화살촉). 이식 된 Procr + EC는 matrix plug assay (옆구리 피부 아래에 삽입 됨)에서 혈관을 생성 할 수 있지만, 형성된 혈관은 모세 혈관 형으로 만 나타납니다 ( 그림 2A ; Yu 등 8 ).
Procr + VESC에 의해 형성된 선박의 기능성 :
GFP + v유방 지방 패드의 에셀은 기능적 순환계 혈관계의 일부이며, isolectin은 수확 전에 정맥 주사에 의해 투여됩니다. GFP + 혈관은 isolectin +이었으며, 형성된 혈관이 밝혀지고 숙주 혈관계와 연결되어 있음을 나타냅니다 ( 그림 2B , Yu 등 8 ).
Procr CreERT2를 사용하는 유방 VESC 계통 추적 ; Rosa26 mTmG 마우스 모델 :
Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG 마우스는 생체 내 Procr + VESCs의 운명 추적에 사용되었습니다 ( 그림 3A ). Procr + VESCs가 유방 내 사춘기 발달 과정에서 강력한 혈관 신생과 혈관 재 형성에 어떻게 기여하는지 알아보기 위해 Procr CreERT2 ; Rosa26 mTmG 를 투여 하였다d를 타목시펜으로 처리하여 Procr + 내피 집단에서 GFP 발현을 유도 하였다. 약물 치료 된 Procr CreERT2 의 유방 지방 패드 ; Rosa26 mTmG 생쥐는 단기간 (주사 후 2 일, 그림 3B )과 장기간 (주사 후 10 개월까지, 그림 3C -F, 허가를 받아 Yu 외 8 에서 적응시킨 그림 ) 수확했다. 추적 결과를 시각화하기 위해 전체 탑재 준비가 수행되었습니다. 혈관 내피의 동일성은 내피 표면 마커 인 VE-Cadherin (Cdh5; 그림 3B , 오른쪽 이미지)으로 염색함으로써 확인 될 수 있습니다.
그림 1 : 마우스 유선에서의 VESC 분석. 8 주 된 C57BL / 6 유선 전자에서 Procr 발현의 FACS 분석. 8 주 된 virgin C67BL / 6 암컷 생쥐를 유선 분쇄에 사용 하였다. 세포 샘플을 준비한 후, 염색되지 않은 샘플 및 각 단색 대조군을 분석하여 각 색상의 전압을 결정 하였다. 보정 파라미터는 자동 형광 또는 배경 염색을 피하기 위해 계산되었습니다. 적절한 게이팅 및 원하는 세포 집단을 분류하기위한 템플릿이 확립되었다. FACS 분류의 계층 구조를 확립하기 위해 모든 사건의 파편을 제거한 다음 이중 덩어리 또는 접착 성 세포 클러스터를 버렸다. 계통 - 세포는 문을 열었고, CD31 및 CD105는 내피 개체군을 정의하는데 사용되었다. Procr + 세포는 FMO 대조군과 비교하여 CD31 + CD105 + EC로부터 분리되었다. 이 수치는 Yu et al. 8 , 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : VESC 유방 뚱뚱한 패드 이식 분석. ( A ) 옆구리 피부의 피하에 삽입 된 기저막 매트릭스 플러그 내의 Procr + EC로 형성된 용기. ( B ) 숙주 유선 혈관계에 이식 된 Procr + EC (GFP +)의 통합 및 기여를 나타내는 수유부 유방 지방 패드의 공 촛점 이미지. EC는 CD31으로 대조 염색되었다. ( C ) isolectin으로 수령 생쥐에 정맥 주사는 outgrowths가 밝혀 혈관을 형성 것을 보여 주었다. 스케일 바, 50 μm. 이미지는 40X NA 1.3 오일 목표를 사용하여 획득했습니다. Z- 스택의 타일 스캔은 1,024 x 1,024의 광학 섹션 해상도에서 얻었으며 각 레이어는 1.0 - 1.2 μm 떨어져있었습니다. 올바른 형광 신호를 포착하기 위해 필터 빔 스플리터를 TD 488/553/638으로 설정하고 gPMT Gain 600 ~ 800에서 설정. 다음의 여기 / 방출 소스가 사용되었습니다. mGFP, 여기 / 방출 최대 값은 488/509 nm입니다. mTomato, 여기 / 방출 최대 값은 532/588 nm입니다. Alexa-647, 여기 / 방출 최대 값은 594/665; 및 DAPI (350 / 470의 여기 / 방출 최대 값). 이 수치는 Yu et al. 8 , 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Procr + EC의 계보 추적은 개발 중 EC Clonal 확장에 대한 기여도를 입증합니다. ( A ) Procr CreERT2를 이용한 계보 추적 전략의 예 ; Rosa26 mTmG 라인 (왼쪽 패널). 실험적(2 일) 및 장기 (7 일 -10 개월)에 사용 된 설정 (오른쪽 패널). ( BF ) 추적 기간의 다른 길이 후 유방 vasculature의 전체 마운트 공 촛점 이미징, 라벨 Procr + EC의 초기 위치와 다양한 추적 단계에서 유방 vasculature에 대한 그들의 기여를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 수치는 Yu et al. 8 , 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
혈관 신생 분석은 혈관 역학을 연구하기위한 훌륭한 실험적 접근 방법입니다. 출생 개발 마우스 망막 혈관은 혈관 신생 (12)을 연구하는 매력적인 모델로 입증되었습니다. 비교적 접근하기 쉽지만 망막 혈관 내에서의 실제 조작은 다소 어렵습니다. 지금까지 가장 잘 설명 된 생체 내 이식은 수혈 마우스의 옆구리 부위에 피하로 주사하거나 주입하는 피하 시험입니다. 이러한 혈관 신생 분석은 내장 세포의 재생 잠재력 및 혈관 형성 능력을 시험하는데 효과적이다. 그러나, 이식 된 매트릭스 플러그의 위치는 세포 내에서 비교적 고립 된 환경을 생성하기 때문에, 최적의 생리 학적 틈새를 제공하지 못한다. 최근에, 새로운 폐 혈관 신생 모델은 또한 표면에 피브린 패치를 적용하여 개발되었다마우스 폐의 부위 13 . 그러나,이 기법은 마우스 흉강 내에서 침습적으로 작용하기 때문에, 조작은 또 다른 위험을 야기하므로 좀 더 일반화 된 분석 설정에서 사용하기가 어렵습니다.
여기에 설명 된 혈관 신생 분석에서 작은 양의 세포 혼합물이 유방의 지방 패드에 이식되어 사춘기 동안 공간, 기질 및 풍부한 혈관 신생 자극을 제공합니다. 이를 통해 생성 된 혈관을 재구성하여 숙주 혈관계를 재구성하고 기능적 평가를 할 수 있으며 피하 플러그 분석에 대한 이점을 나타낼 수 있습니다. 또한 유방 지방 패드는 복강 외측에 위치하여 매우 접근하기 쉬운 부위입니다. 유방 지방 패드에서의 수술은 레티 날 및 폐 기반 분석법과 관련된 침습적 인 수술 절차를 피하면서 수혜 대상 동물에게 제한된 어려움을 초래합니다.
혈액 vasculature 위트hin은 조직 구성 요소 사이를 종종 연결하여 혈관 커버리지를 최대화하므로 혈액 산소 및 물질 전달의 공급을 최적화 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 조직의 통상적 인 구획화는 종종 그 혈관의 관형 구조를 가로 채게된다. 혈관 특성에 대한 분석은 혈관을 보존하고 손상되지 않은 채로 유지하는 것이 가장 좋습니다. 조직의 전체 마운트 준비는 대개 혈관 건축의 전체를 보존 할 수 있습니다. 이 방법은 장기 내의 혈관의 실제 공간 분포뿐만 아니라 다른 조직 구성 요소와의 관계를 관찰 할 수 있습니다.
줄기 세포를 함유 한 조직의 항상성은 세포 질량의 발생과 손실의 균형을 유지함으로써 유지됩니다. 특정 거주하는 장기 내의 줄기 세포는 종종 보호되고 줄기 세포 틈새라고하는 주변 조직 환경과 밀접하게 접촉합니다. 그러므로, stu성체 줄기 세포 조직을 분석하는 다이는 바람직하게는 생리적 인 맥락에서 수행되어야한다. 이식 분석은 세포 잠재력을 평가하는 수단을 제공 할 수 있으며 혈통 추적 기술은 토착 서식지 내에서 진정한 세포의 운명을 탐구 할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 생체 내 혈통 추적은 줄기 특성의 실험적 평가를위한 강력한 기술이되었습니다. 이 전략은 창자 10 , 14 , 모낭 15 , 위 16 및 췌장 17을 포함한 여러 조직에서 조직 잔여 줄기 세포와 그 자손을 확인하는 데 사용되었습니다. 계보 추적 방법은 주로 줄기 세포의 유전 적 마킹에 의존하며 한정된 개체군에서 시작됩니다. 따라서 실제 줄기 세포가 표적 세포 내에서보다 작은 집단에서 발견 될 가능성을 배제하는 것은 어렵다. 따라서 추적 된 복제물의 원산지를 정밀하게 매핑하고 시간 경과에 따른 추적 효율성을 정량적으로 측정하는 것이 필수적입니다. 그렇게하여 표식 집단의자가 재생 능력을 파악할 수 있습니다.
기술 된 혈관 신생 분석은 특정 연구 목적을 위해 변형 될 수있다 : 관심있는 내피 집단의 혈관 생성 능력을 시험 할뿐만 아니라 국소 혈관 재 형성에 대한 혈관 신생 인자의 효과를 평가할 수있다. 그러나 유방이 다양한 발달 단계 ( 예 : 사춘기, 발정주기 및 임신) 동안 동적 인 형태 학적 변화를 겪기 때문에 결과 해석 중에 호르몬 수준 변동과 같은 전신 변화의 영향을 고려해야합니다. 이 분석의 중요한 단계는 기본 endothelial 세포 격리를 포함합니다. 생존 가능한 이식 용 세포를 최적으로 얻으려면 FACS 분리 절차가 be 부드럽게 수행. 세포 펠렛의 풀림이나 현탁과 같은 세포 준비 과정에서의 가혹한 취급을 피하기 위해주의해야합니다. 또 다른 중요한 단계는 지방 혼합물에 세포 혼합물을 주입하는 것입니다. 뚱뚱한 패드 주입 도중, 세포 혼합물이 뚱뚱한 패드 안쪽에 정확하게 놓인 ㄴ다는 것을 보증하는 것이 중요합니다. 바늘 삽입이 너무 깊거나 얕은 경우 또는 전체 용량이 권장 용량을 초과하는 경우 까다로운 수 있습니다.
이 프로토콜은 내피 줄기 세포 인구의 식별에 도움이 일련의 실험 방법을 제공합니다. 이러한 기술을 통해 이식을 통한 줄기 세포 특성을 평가 하고 생체 내 에서 생리적 과정 에서 의 행동을 추적 및 관찰 할 수있었습니다. 이러한 접근법은 종양 환경에서의 내피 집단 연구와 세포 효능의 변화를 포함하여 여러 분야에 적용 할 수있는 효율적인 도구입니다. 나는특히 지방 패드 이식 및 전체 마운트 준비는 혈관 생물학의 다양한 측면을 조사하기위한 향후 노력을 도울 수있는 재현 가능하고 강력한 방법입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31530045 및 31371500, YAZ, 31401245, QCY), 중국 과학 기술부 (2014CB964800), 중국 과학원 (XDB19000000 - YAZ), 중국 세포 생물학 학회 (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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