Microscopía fotoacústica de resolución óptica y acústica conmutable para<em> In Vivo</em> Imágenes de vasos sanguíneos de pequeños animales
Summary
Aquí se demuestra un sistema de microscopía fotoacústica (AR-OR-PAM) de resolución acústica conmutable (AR) y resolución óptica (AR-OR-PAM) capaz tanto de imágenes de alta resolución en profundidad superficial como de imágenes de tejido profundo de baja resolución en la misma muestra in vivo .
Abstract
La microscopía fotoacústica (PAM) es una modalidad de imagen in vivo de rápido crecimiento que combina óptica y ultrasonido, proporcionando una penetración más allá de la trayectoria libre media óptica (~ 1 mm en la piel) con alta resolución. Al combinar el contraste de absorción óptica con la alta resolución espacial del ultrasonido en una sola modalidad, esta técnica puede penetrar tejidos profundos. Los sistemas de microscopía fotoacústica pueden tener una baja resolución acústica y una sonda profunda o una alta resolución óptica y una sonda poco profunda. Es difícil lograr una alta resolución espacial y una gran penetración en profundidad con un único sistema. Este trabajo presenta un sistema AR-OR-PAM capaz tanto de imágenes de alta resolución a profundidades poco profundas como de imágenes de tejido profundo de baja resolución de la misma muestra in vivo . Una resolución lateral de 4 μm con una profundidad de imagen de 1,4 mm utilizando enfoque óptico y una resolución lateral de 45 μm con una profundidad de imagen de 7,8 mm utilizando enfoque acústico fueron exitosasDemostrado utilizando el sistema combinado. En este caso, se realiza una proyección de imagen vascular de sangre de animal pequeño in vivo para demostrar su capacidad de formación de imágenes biológicas.
Introduction
Las modalidades ópticas de imágenes de alta resolución, como la tomografía de coherencia óptica, la microscopía confocal y la microscopía multifotónica, tienen numerosos beneficios. Sin embargo, la resolución espacial disminuye significativamente a medida que aumenta la profundidad de formación de imágenes. Esto se debe a la naturaleza difusa del transporte ligero en tejidos blandos 1 , 2 . La integración de la excitación óptica y la detección de ultrasonidos proporciona una solución para superar el reto de la imagen óptica de alta resolución en tejidos profundos. La microscopía fotoacústica (PAM) es una modalidad de este tipo que puede proporcionar imágenes más profundas que otras modalidades de imagen óptica. Se ha aplicado con éxito a imágenes estructurales, funcionales, moleculares y de células in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 </sup> , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 combinando el fuerte contraste de absorción óptica con la alta resolución espacial del ultrasonido.
En PAM, un pulso láser corto irradia el tejido / muestra. La absorción de luz por los cromóforos ( por ejemplo, melanina, hemoglobina, agua, etc. ) produce un aumento de la temperatura, que a su vez produce la producción de ondas de presión en forma de ondas acústicas (ondas fotoacústicas). Las ondas fotoacústicas generadas pueden ser detectadas por un transductor ultrasónico de banda ancha fuera del límite del tejido. Utilizando óptica débil y acústica de enfoque apretado, imágenes de tejidos profundos se puede lograr en la microscopía fotoacústica de resolución acústica (AR-PAM) [ 14 , 15 , 16] . En ar-PAM, se ha demostrado una resolución lateral de 45 μm y una profundidad de imagen de hasta 3 mm 15 . Con el fin de resolver acústicamente capilares individuales (~ 5 μm), se requieren transductores ultrasónicos que funcionen a frecuencias centrales de> 400 MHz. A tales frecuencias altas, la profundidad de penetración es inferior a 100 μm. El problema causado por el enfoque acústico apretado puede ser resuelto usando el enfoque óptico apretado. La microscopía fotoacústica de resolución óptica (OR-PAM) es capaz de resolver capilares únicos, o incluso una sola célula 17 , y una resolución lateral de 0,5 μm se ha logrado 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . El uso de un nanojet fotónico puede ayudar a lograr una resolución más allá de la resolución limitada por difracciónN 25 , 26 . En OR-PAM, la profundidad de penetración es limitada debido al enfoque de la luz, y puede imagen hasta ~ 1,2 mm dentro del tejido biológico [ 23] . Por lo tanto, AR-PAM puede imagen más profunda, pero con una resolución más baja, y OR-PAM puede imagen con una resolución muy alta, pero con una profundidad de imagen limitada. La velocidad de formación de imágenes del sistema AR y OR-PAM depende principalmente de la velocidad de repetición del impulso de la fuente láser 27 .
La combinación de AR-PAM y OR-PAM será de gran beneficio para las aplicaciones que requieren una alta resolución y una imagen más profunda. Se ha hecho poco esfuerzo para combinar estos sistemas. Por lo general, se utilizan dos escáneres de imágenes diferentes para la formación de imágenes, lo que requiere que la muestra se mueva entre ambos sistemas, lo que dificulta la realización de imágenes in vivo . Sin embargo, la imagen híbrida con AR y OR PAM permite la creación de imágenes con resoluciones escalables aNd profundidades. En un enfoque, se utiliza un haz de fibras ópticas para suministrar luz tanto para AR como para OR PAM. En este enfoque, se utilizan dos láseres separados (un láser de alta energía a 570 nm para el AR y un láser de baja energía y alta frecuencia de repetición a 532 nm para el OR), lo que hace que el sistema resulte inconveniente y caro 28 . La longitud de onda del láser OR-PAM es fija, y muchos estudios, como la saturación de oxígeno, no son posibles utilizando este sistema combinado. Los estudios comparativos entre AR y OR PAM tampoco son posibles debido a la diferencia en las longitudes de onda del láser entre AR y OR. Además, AR-PAM utiliza iluminación de campo brillante; Por lo tanto, las señales fotoacústicas fuertes de la superficie de la piel limitan la calidad de la imagen. Por esta razón, el sistema no puede utilizarse para muchas aplicaciones de bioimagen. En otro enfoque para realizar AR y OR PAM, el enfoque óptico y ultrasónico se desplaza, lo que hace que el enfoque de la luz y el enfoque ultrasónico no estén alineados. Por lo tanto, la calidad de imagen no es óptima <suP class = "xref"> 29. Utilizando esta técnica, el AR-PAM y el OR-PAM pueden lograr resoluciones de sólo 139 μm y 21 μm, respectivamente, lo que lo convierte en un sistema de baja resolución. Otro enfoque, que incluye el cambio de la fibra óptica y la óptica de colimación, se informó que cambia entre AR y OR PAM, haciendo que el proceso de alineación difícil 30 . En todos estos casos, AR-PAM no utilizó iluminación de campo oscuro. El uso de la iluminación de campo oscuro puede reducir la generación de señales fotoacústicas fuertes de la superficie de la piel. Por lo tanto, la formación de imágenes de tejidos profundos se puede realizar utilizando iluminación en forma de anillo, ya que la sensibilidad de detección de las señales fotoacústicas profundas será mayor comparada con la de la iluminación de campo brillante.
Este trabajo reporta un AR conmutable y OR PAM (AR-OR-PAM) sistema de imagen capaz de tanto de alta resolución de imágenes y de baja resolución de imágenes de tejido profundo de la misma muestra, utilizando el mismo láser y escáner para ambos sistemasEms El rendimiento del sistema AR-OR-PAM se caracterizó por la determinación de la resolución espacial y la profundidad de la imagen utilizando experimentos fantasma. Se realizó imágenes de vasculatura sanguínea in vivo en un oído de ratón para demostrar su capacidad de formación de imágenes biológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En conclusión, se ha desarrollado un sistema AR y OR PAM conmutable que puede conseguir tanto imágenes de alta resolución a profundidades de formación de imágenes inferiores como imágenes de baja resolución a profundidades de formación de imágenes más altas. Se determinó la resolución lateral y la profundidad de formación de imágenes del sistema conmutable. Las ventajas de este sistema PAM conmutable incluyen: (1) la formación de imágenes de alta resolución utilizando enfoque óptico ajustado; (2) la ob…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el apoyo financiero de una subvención de Nivel 2 financiada por el Ministerio de Educación de Singapur (ARC2 / 15: M4020238). Los autores también quisieran agradecer al Sr. Chow Wai Hoong Bobby por la ayuda de la tienda de maquinaria.
Materials
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
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