Summary
Este artículo describe dos nuevos plugins de ImageJ para el análisis de imágenes 'Clock Scan'. Estos plugins amplían la funcionalidad del programa visual basic 6 original y, lo que es más importante, ponen el programa a disposición de una gran comunidad de investigación al agruparla con el paquete de software de análisis de imágenes gratuito ImageJ.
Abstract
El protocolo de exploración de reloj para el análisis de imagen es una herramienta eficaz para cuantificar la intensidad media de píxel dentro, en el borde y fuera (de fondo) de una región de interés convexa en forma convexa cerrada o segmentada, que conduce a la generación de un píxel radial integral integral, Perfil de intensidad. Este protocolo se desarrolló originalmente en 2006, como un guión visual básico 6, pero como tal, tenía una distribución limitada. Para abordar este problema y unir esfuerzos recientes similares de otros, hemos convertido el código original del protocolo de análisis de reloj en dos complementos basados en Java compatibles con programas de análisis de imágenes patrocinados por NIH como ImageJ o ImageJ de Fiji. Además, estos complementos tienen varias funciones nuevas, ampliando aún más el rango de capacidades del protocolo original, como el análisis de múltiples regiones de interés y pilas de imágenes. Esta última característica del programa es especialmente útil en aplicaciones en las que es importante determinar los cambios relacionadosA tiempo y lugar. Por lo tanto, el análisis de la sincronización del reloj de las pilas de imágenes biológicas puede aplicarse potencialmente a la difusión de Na + o Ca ++ dentro de una sola célula, así como al análisis de la propagación de la actividad ( por ejemplo , ondas Ca ++ ) en poblaciones de sináptica -conexiones conectadas o unidas a uniones de separación. Aquí, describimos estos nuevos plugins de exploración de reloj y mostrar algunos ejemplos de sus aplicaciones en el análisis de imágenes.
Introduction
El objetivo de este trabajo es presentar un protocolo Clock Scan que esté libre de plataforma y que esté libremente disponible para cualquier investigador interesado en este tipo de análisis de imagen. El protocolo Clock Scan se desarrolló originalmente en 2006 1 , con el objetivo de mejorar los métodos existentes de cuantificación de la intensidad de píxeles dentro de las regiones de interés convexas (ROI), un método que tiene una mejor capacidad de integración y una mejor resolución espacial. Durante la adquisición, el protocolo recoge secuencialmente múltiples perfiles radiales de intensidad de píxeles, escaneados desde el centro ROI hasta su borde, oa una distancia predeterminada fuera del ROI con el fin de medir la intensidad del píxel "de fondo". El protocolo escala estos perfiles según el radio de la célula, medido en la dirección de la exploración. Por lo tanto, la distancia desde el centro hasta el borde de ROI de cada exploración radial individual es siempre el 100% de la escala X. Por último, el programa promedia estosAl en un perfil integral radial de intensidad de píxeles. Debido a la escala, el perfil de intensidad de píxel medio, producido por el protocolo "Clock Scan", no depende del tamaño del ROI ni, dentro de límites razonables, de la forma de ROI. Este método permite la comparación directa o, si es necesario, el promedio o la sustracción de perfiles de diferentes ROI. El protocolo también permite la corrección de los perfiles integrales de intensidad de píxel, de cualquier objeto para el ruido de fondo, mediante una simple sustracción de la intensidad media de píxeles situados fuera del objeto. Aunque sólo ha sido probado en muestras biológicas, nuestro protocolo proporciona una valiosa adición a otras herramientas de análisis de imágenes existentes utilizadas en estudios de imágenes de procesos físicos o químicos que están dispuestos alrededor de un punto de origen (como la difusión de sustancias desde una fuente puntual ) 1 .
Sin embargo, la principal limitación del método de análisis de imagen original era que el protocolo era devEloped como un Visual Basic 6 (VB6) (código, y por lo tanto, era dependiente de la plataforma y difícil de distribuir (que requieren VB6). Para abordar este problema y unirse a esfuerzos recientes similares por otros investigadores 2 , convertimos el VB6 Clock Scan Código de programa en dos complementos basados en Java, compatibles con los programas de análisis de imágenes open-source y independiente de plataforma patrocinados por NIH, ImageJ 3 y Fiji ImageJ 4. Además, estos plugins tienen ahora varias funciones nuevas que expanden la capacidad Del protocolo original para procesar múltiples ROIs y pilas de imagen.Muchas aplicaciones de análisis de imágenes no son fáciles de usar, con respecto a la realización de análisis estadístico de objetos múltiples, y por lo tanto, a menudo sólo los datos representativos se muestran.Con el complemento de Clock Clock ScanJim, Es posible facilitar el análisis de objetos múltiples simultáneamente.Una evaluación estadística robusta de los datos de microscopía,Con respecto a la distribución de la intensidad de señal en células / objetos individuales, ahora es posible con esta extensión de complemento. Aquí describimos los plugins de la exploración de reloj y mostramos ejemplos de sus aplicaciones en el análisis de imágenes.
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Protocol
1. Instalación del software
- Instale las últimas versiones de Java y ImageJ o Fiji ImageJ como se recomienda en los respectivos sitios web (vea la tabla de materiales para los enlaces a los sitios web correspondientes). En el texto a continuación, ambos programas se denominan "ImageJ".
- Copie los archivos de plugins "Clock_Scan-1.0.1. Jar" y "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" utilizando el enlace proporcionado en la tabla de materiales y péguelos en el directorio de plugins de ImageJ. Como alternativa, use la opción de menú "Plugins | Install plugin" para instalar estos archivos después de haberlos guardado en el disco duro del ordenador.
2. Análisis de la exploración del reloj
- Plugin de exploración del reloj estándar ( Figura 1 ):
- Utilice el comando de menú "Archivo | Abrir" de ImageJ para abrir una imagen de interés.
- Haga clic en la herramienta 'polígono' o 'selección de línea segmentada', Y luego dibujar en la imagen para delinear el ROI completo o un segmento de esta región. Vea la Figura 1 A para un ejemplo de selección de polígonos (contorno interior discontinuo).
NOTA: También se pueden usar otras herramientas de selección, disponibles en el software (selección de rectángulo, oval y de línea libre). - Seleccione "Plugins | Clock Scan" en el menú para abrir la ventana de opciones emergentes del protocolo de análisis de reloj estándar. Tenga en cuenta que este comando también abrirá la ventana Administrador de ROI con el esquema agregado automáticamente a él.
- Utilice la ventana de opciones del complemento para hacer lo siguiente.
- Revise y cambie las coordenadas X e Y del centro de ROI (calculadas automáticamente como coordenadas del centro de masa física) utilizando barras de desplazamiento o cambiando los valores en los cuadros de entrada correspondientes. Vea la Figura 1 B.
- Dependiendo de la cantidad de la región de fondo fuera del objeto shoPuede ser cubierto por el escaneado, ajuste los límites de escaneado utilizando la barra de desplazamiento "límite de escaneado". Vea la Figura 1 A.
NOTA: El límite de exploración es el número fraccionario que representa hasta qué punto el escaneo debe proceder más allá del borde de los objetos en cualquier dirección dada; El valor predeterminado es 1.20, lo que indica que la longitud de la exploración será 20% más larga que el radio del objeto en la dirección de la exploración; Ver Figura 1 A , línea punteada externa). - Modifique la salida del complemento utilizando las casillas de verificación "radio real", "substraer fondo", "transformar polar" y / o "trazar con desviación estándar".
- Haga clic en "Aceptar" para ejecutar el complemento. Véase la figura 1 C-H .
NOTA: Ejemplos de la salida del protocolo con "gráfico con desviación estándar" y "transformada polar" o "radio real" y "transf polar"Orm "seleccionadas se muestran en la Figura 1 C y 1D y Figura 1 E y 1 F. Obsérvese que los valores calculados de desviación estándar (SD) representan la variación entre las exploraciones de intensidad de píxeles radiales individuales del objeto.También tenga en cuenta la" selección ROI Longitud "en la ventana del complemento, que muestra la información sobre la longitud del esquema ROI medida en píxeles.
- En el "Trazado de perfil de exploración de reloj" generado, utilice el comando "Listar" para trazar valores mostrados en dos columnas X e Y de datos para imágenes en escala de grises y en X y cuatro columnas Y de imágenes RGB, Las columnas Y1, Y2 e Y3 se llenarán con valores de intensidad de píxeles de canal de color integrales e individuales (rojo, verde y azul).
- Múltiples ROI Clock Scan plugin - trabajando con múltiples ROI (
): - Abra una imagen que contenga varios ROI.
- Abra el Administrador de ROI haciendo clic en "Analyze | Tools | ROI Manager".
- Haga un bosquejo secuencial (consulte el paso 2.1.2) y añada cada ROI al Gestor de ROI haciendo clic en "Agregar" en la ventana Administrador de ROI; Haga esto para todos los ROI dentro de la imagen. Utilice el comando "Analyze | Measure" si las métricas ROI son de interés.
- Vea la Figura 2 A para un ejemplo de selecciones de líneas segmentadas múltiples y la Figura 2 E para un ejemplo de múltiples selecciones de polígonos.
- Seleccione "Multi Clock Scan" en el menú "Plugins" para abrir la ventana emergente de opciones de protocolo.
- Utilice la ventana de opciones de protocolo para hacer lo siguiente.
- Si es necesario, restablezca el límite de escaneo según el paso 2.1.4.2; El valor predeterminado es 1,20.
- Si es necesario, seleccione la opciónIon para trazar el perfil de barrido de reloj medio con barras SD marcando la casilla "Trazar con desviación estándar". Véase la figura 2 C y D.
NOTA: Los valores de SD calculados representarán la variación entre los perfiles de exploración de reloj integrales de diferentes objetos. Además, anote la línea en la ventana del complemento mostrando información sobre el "número de ROIs seleccionados". - Haga clic en "Aceptar" para ejecutar el protocolo.
- En el "Trazado del perfil de exploración de reloj" generado, utilice el comando "Listar" para trazar los valores mostrados en la ventana "Valores de trazado". Vea la leyenda de la ventana "Trazado del perfil de exploración de varios relojes" para la designación de columnas por canal de color.
- Tenga en cuenta que los ROI están numerados y sus perfiles de exploración de reloj para cualquier canal de color dado se representan en la misma secuencia en la que se describieron los ROI y se agregaron al "ROI Manager".
- MulTiple ROI Plugin de exploración de reloj - trabajando con una pila de imágenes ( Figura 3 ):
- Abra una pila de imágenes de interés.
- Abra el Administrador de ROI haciendo clic en "Analyze | Tools | ROI Manager".
- Describa el ROI de las imágenes dentro de la pila y agréguelas al administrador de ROI como se describe en los pasos 2.1.2 y 2.2.3. Utilice el comando "Analyze | Measure" si las métricas ROI son de interés.
- Seleccione "Multi Clock Scan" en el menú "Plugins" para abrir la ventana emergente de opciones de protocolo.
- Utilice la ventana de opciones de protocolo para hacer lo siguiente.
- Restablezca el límite de exploración como se describe en el paso 2.1.4.2; El valor predeterminado es 1,20.
- Seleccione la opción para trazar el perfil de barrido de reloj medio con barras SD marcando la casilla "Trazar con desviación estándar".
NOTA: Los valores de SD calculados representarán la variación entre diferentes instancias del objeto seleccionado en la imagen staCk Además, tenga en cuenta la línea en la ventana de complemento que muestra información sobre el "número de imágenes en la pila". - Haga clic en "Aceptar" para ejecutar el protocolo.
- En la ventana "Trazado de perfil de exploración de reloj", haga clic en "Listar" para trazar los valores mostrados en la ventana "Valores de trazado", donde el número de columna Y representa la posición de la imagen dentro de la pila - 1.
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Representative Results
Las imágenes que se utilizan aquí con fines ilustrativos, se toman de las bases de datos creadas durante nuestros anteriores estudios biológicos de células y tejidos 5 , 6 , 7 y de Allen Mouse Brain Atlas 8 . Ambos plugins se probaron con éxito utilizando el entorno de programa ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 y Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66.
La Figura 1 muestra los resultados representativos del análisis de imágenes con un plugin de exploración de reloj estándar. Para ambos plugins, el código básico y los pasos principales del procedimiento de exploración de reloj son esencialmente los mismos que se describen en el protocolo original 1 . En pocas palabras, después de que el ROI o un segmento de la ROI se describe en la imagen ( Figura 1 A , contorno amarillo interior) y un centro del contorno se determina (automáticamente o manualmente, usando la ventana de opción de complemento, Figura 1 B ), el escaneado radial de la intensidad de los píxeles comienza en una dirección desde el centro hasta el primer píxel de la Y continúa en sentido horario píxel a píxel a lo largo del contorno ( Figura 1 A : vector recto y flecha curvada, respectivamente) hasta que se analizan todos los radios ROI. Para cuantificar la intensidad de fondo ROI, la longitud de cada exploración radial se puede establecer para exceder el radio del ROI en la dirección de la exploración por un número fraccionario preestablecido (0.2 ó 20% del radio en defecto para el valor del complemento Clock Scan , Línea amarilla exterior en la Figura 1 A ). Los perfiles radiales reunidos se alinean entonces escalando a los radios correspondientes y promediados para producir el perfil de intensidad de exploración de reloj integral en 256 niveles de intensidad de las unidades de escala de grises ( Figura 1 C ). Para las imágenes RGB, ambos plugins producen automáticamente perfiles de intensidad de píxeles radiales integrales independientes para cada canal de color (256 niveles de intensidad de colores rojo, verde y azul) además de un perfil de color combinado.
Por defecto, la escala x del perfil de intensidad de los píxeles de la exploración del reloj representa el radio ROI normalizado, con 100% de la escala representando los píxeles situados en el borde del ROI ( Figura 1C ). El perfil mostrado en la Figura 1 C se generó con la opción "parcela con desviación estándar" seleccionada y, por lo tanto, el gráfico también muestra el SD calculado para cada punto de datos a lo largo de la escala X del perfil. Cuando se selecciona la opción "restar fondo", todo el perfil de intensidad se corrige para el fondo noPor substracción punto por punto de la intensidad media de los píxeles situados entre el borde del ROI y el borde límite de la exploración (línea amarilla exterior en la figura 1A, datos no mostrados). Si se selecciona la opción "transformar polar", el complemento de exploración de reloj genera una ventana de salida adicional. Contiene una transformación polar de la imagen de la región seleccionada incluyendo el territorio de límite de exploración, en el que la imagen se modifica en cada dirección de exploración radial de tal manera que la distancia desde el centro hasta el borde de los objetos se normaliza siempre a 100 % Y representado por 100 píxeles. Independientemente del tamaño real del objeto, las dimensiones vertical y horizontal de su imagen de transformación polar son dos veces el límite de exploración en píxeles (240 píxeles x 240 píxeles en el ejemplo mostrado en la figura 1D ). Por último, al seleccionar la opción "radio real" se obtendrá la generación del relojY una imagen de transformación polar, escalada por el radio medio real del objeto y en las unidades de calibración espacial de la imagen original ( Figuras 1E y F , respectivamente).
Las Figuras 1G y H ilustran opciones de análisis de imagen adicionales usando la transformación polar independiente del tamaño y forma del objeto y los comandos y herramientas ImageJ integrados. Ejemplos de comandos que pueden considerarse útiles para ciertos tipos de análisis de imagen son la herramienta de línea segmentada y el comando "Analizar perfil de trazado" ( Figura 1 G ) y el comando "Analizar trama de superficie" ( Figura 1 H ).
Las Figuras 2 y 3 muestran resultados representativos del análisis de imágenes con el complemento Multi Clock Scan. La salida de laEl complemento de exploración de reloj múltiple consta de dos gráficos: el primer gráfico muestra perfiles de exploración de reloj individuales de los objetos seleccionados ( Figura 2C), y el segundo gráfico muestra la media de estos perfiles de exploración de reloj individuales (± SD, opcional, Figura 2D ) . Para las imágenes RGB ( Figura 2 E ), también se muestra el perfil de exploración de reloj calculado para cada canal de color individual para cada ROI seleccionado ( Figura 2F), y la media se calcula dentro de un canal dado para todos los objetos seleccionados ( Figura 2G) . Del mismo modo, se muestran los perfiles de exploración de reloj individuales y medios para objetos en la pila de imágenes después de realizar el análisis de exploración de reloj de la pila ( Figuras 3A a 3D , no se muestra el perfil de exploración de reloj medio). Como se indicó anteriormente, el númeroAl se utilizan para generar estas gráficas ejecutando el comando "Lista" del trazado.
La Figura 4 ilustra una aplicación adicional de la opción de transformación polar en el plugin de exploración de reloj: su idoneidad para el registro de imágenes y las operaciones de superposición. En esta figura, se utilizaron transformaciones polares independientes del tamaño y de la forma de ROI para comparar la distribución del marcaje de fluorescencia de las neuronas que expresan la bomba α3 de sodio / potasio-ATPasa entre diferentes regiones corticales de ratón, con la imagen del atlas mostrando los bordes y la organización anatómica de Estas regiones ( Figuras 4A-4B ). Con un protocolo de exploración de reloj, el registro de referencia (atlas) y las imágenes reales requeridas para dicha comparación se limitan a un procedimiento simple de alineación de las imágenes, delineando la estructura de interés en ambas imágenes y generando después el tamaño de ROI y la forma, Transformaciones polares independientes.En el ejemplo mostrado en la Figura 4 , una comparación de transformaciones polares demuestra claramente una distribución no uniforme de células marcadas en la corteza cerebral de ratón, siendo su densidad específicamente alta en áreas superficiales de la capa 2 / 3rds de la corteza motora, la parte dorsal De la corteza insular agranular, la corteza orbital lateral y en capas profundas de la corteza motora ( Figuras 4C-4D ).
Figura 1 : Ejemplo representativo de aplicación del complemento de exploración de reloj para análisis de imagen. ( A ) Imagen de luz fluorescente de una sección de un ganglio de la raíz dorsal de rata inmunotinada para la isoforma α3 de la Na + / K + ATPasa (α3 NKA, véase Schneider et al.3 para los detalles del procesamiento y tinción de tejidos).Uno de los perfiles neuronales, con su borde fuertemente marcado para α3 NKA (blanco), se esboza utilizando una herramienta de línea de polígono (línea amarilla interna). Los límites de la exploración radial (flecha blanca) se ajustaron a 120% del radio del objeto, desde el centro del objeto (punto blanco) hasta el primer píxel del contorno, como se muestra en el panel B (barra de desplazamiento del límite de exploración). ( B ) Captura de pantalla de la ventana de opciones principales del complemento de exploración de reloj. ( C ) Trama del perfil integral de intensidad de píxeles de la celda mostrada en el panel A (media de 706 perfiles de barrido radial, ver longitud de contorno en B, barras verticales son barras SD). ( D ) - Imagen de transformación polar del perfil celular estudiado. ( E ) Perfil de exploración de reloj de la misma celda obtenido con la opción de "radio real" seleccionada. Tenga en cuenta que a diferencia del perfil mostrado en C, la escala x de este perfil muestra unidades de calibración espacial real (μm). ( F ) Transformación polar de la misma célula obtenida con la Opción de "radio real". Obsérvese que la escala de esta transformación está ahora en unidades de calibración espacial real (μm). ( G ) El borde de la transformación polar, que se muestra en D, se esbozó utilizando la herramienta de línea segmentada (espesor de la línea se estableció en 10 píxeles o el 10% de la longitud de exploración radial) y analizados. Se ha ejecutado el comando "Análisis de perfil de trazado" para medir los cambios en la intensidad media del etiquetado a lo largo del borde del objeto (cada punto de datos del gráfico representa la intensidad media de todos los píxeles a través del ancho de la línea de selección). ( H ) El comando "Analyze | Surface Plot" se aplicó a la imagen de transformación polar mostrada en el panel D para crear una representación tridimensional de la intensidad de etiquetado del objeto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2 : Ejemplo representativo Aplicación del uso del complemento de análisis de reloj múltiple para el análisis de imagen. ( A ) Se capturaron cuatro campos de visión dentro de la sección de ganglio de raíz dorsal de rata inmunotinada para α3 NKA (véase la Figura 1 ). Para simplificar el uso del complemento de exploración de reloj múltiple, estas imágenes se colocaron en una pila y luego se convirtieron en una sola imagen utilizando el comando "Image | Stacks | Make Montage". Las líneas y los números rojos indican una línea segmentada de selecciones de cinco regiones de interés en esta imagen. ( B ) Se muestra una captura de pantalla de la ventana Multi Clock Scan cuando se usa el complemento para analizar una imagen a escala de grises. ( C ) Perfiles individuales de barrido de reloj de cinco ROIs 'mostrados en el panel A. ( D ) Perfil de exploración de reloj promedio para ROIs seleccionados (panelA) con barras SD (opción "trama con desviación estándar" seleccionada). ( E ) imagen RGB de linfocitos pre-B de ratón cultivados, marcados con 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI, tinción nuclear, azul) y con anticuerpos marcados fluorescentemente para β1-integrina (verde) y F-actina , Véase Dobretsov et al 7 para la técnica de cultivo celular y Yuryev et al 11 para detalles de tinción). Se delinearon once células (véanse las etiquetas numéricas) utilizando la herramienta de selección de polígonos ImageJ. Los paneles de la derecha muestran la vista de canal verde y rojo de la celda # 7 (selección rectangular en el panel izquierdo) después de que se ejecutó la función de menú "Image | Color | Split Channels". ( F ) Perfiles de escaneo de reloj de célula individuales (los perfiles de canal de color compuesto y rojo, verde y azul se muestran con líneas negras, rojas, verdes y azules, respectivamente). ( G ) Perfiles de escaneo de reloj promedio para los once ROIs seleccionados en el panelE. Designaciones de color como en el panel G (no se usó ningún gráfico con la opción de desviación estándar durante el procedimiento de Escaneo de reloj múltiple). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Plugin de análisis de reloj múltiple y análisis de pilas de imágenes. ( A ) Montaje de marcos de imagen seleccionados y "guardados como pila". En el primer cuadro se muestra una imagen de una neurona de ganglio de la raíz dorsal capturada con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC). Los cuadros posteriores se adquirieron utilizando microscopía de fluorescencia epi-iluminación para monitorear la concentración intracelular de calcio en diferentes intervalos de tiempo, antes y después de la estimulación eléctrica de la célula. Números junto al respectivoLa imagen e indica el tiempo en ms 6 . El borde de la célula se esbozó usando la imagen DIC de la pila (marco superior izquierdo), el asterisco indica la pipeta de parche-abrazadera usada para registrar y llenar la celda con el colorante Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ) Y, a continuación, se utiliza para ejecutar el procedimiento de exploración de reloj múltiple en las imágenes restantes. ( B ) Captura de pantalla de la ventana Multi Clock Scan, cuando el programa se ejecuta en una pila de imágenes. ( C ) Perfiles de exploración de reloj de la señal fluorescente OGB-1 a diferentes distancias desde el centro de la célula (% de radio) y en momentos diferentes antes y después de la estimulación eléctrica (leyenda, en ms). Para preparar estos gráficos se utilizó un software gráfico profesional. ( D ) Cambios en la intensidad de la señal OGB-1 con el tiempo en sub-membranas y regiones de células citoplasmáticas más profundas (círculos y líneas rojos y negros, respectivamente). Para obtener estos datos, se calcularon la media y la DE para cada punto de datosEd entre 20-40% y 70-90% de la escala x de cada perfil de exploración de reloj mostrado en el panel C (áreas sombreadas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Ejemplo de uso del complemento de exploración de reloj en el registro de imagen y la superposición. ( A y B ) Capturas de pantalla de la placa 29 de la sección coronal (Allen Mouse Brain Atlas) y una sección vibratoma de 200 μm de espesor del corte de cerebro de ratón incrustado en gelatina aproximadamente al mismo nivel que la imagen del atlas. El ratón transgénico usado en este ejemplo expresaba la proteína fluorescente ZsGreen bajo el promotor de α3NKA, para identificar las neuronas que expresan α3NKA 2 . Para determinar el(Puntos brillantes en la imagen en el panel B), se esbozó el área cortical entera (líneas discontinuas de color amarillo) comenzando en ambas imágenes con el mismo punto de referencia (frontera media entre la corteza y el olfatorio Bulbo, flechas). ( C ) Los paneles representan (de izquierda a derecha): Clock Scan polar transforma el ROI, seleccionado dentro de la imagen del atlas (panel A), dentro de la imagen de la sección del cerebro del ratón (panel B) y superposición de estas dos imágenes de transformación | Superposición | Agregar imagen "con un ajuste de opacidad del 50%). ( D ) Las mismas imágenes que en el panel C pero con los bordes de las regiones corticales principales (como se muestra en el atlas) esbozadas en otras dos imágenes de transformación usando el polígono ImageJ, las herramientas de selección de línea segmentada y el "Análisis | Herramientas | Sincronizar Windows" mando. Las abreviaturas son las mismas que en la imagen original del atlas del cerebro: Motor primario y secundario (MOp, MOs), agrario insular, dor(AId), orbital lateral, ventro-lateral y medial (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbic (PL), cingulado anterior, parte dorsal (ACAd) corteza. Los números en el área MO se refieren a las capas corticales principales, que se pueden distinguir en la corteza del motor del ratón en el nivel coronal apropiado del cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Clock Scan Protocol: El protocolo Clock Scan es una herramienta rápida y sencilla de análisis de imágenes. Las ventajas de este protocolo, en comparación con los enfoques comunes existentes de análisis de imágenes (tales como exploraciones de intensidad de píxeles lineal o cálculo de la intensidad media de píxel del ROI), se han descrito en detalle en publicaciones anteriores 1 , 9 . En pocas palabras, este protocolo permite la generación de perfiles de intensidad de píxeles radiales integrales mediante la cuantificación de la intensidad de píxeles situados a diferentes distancias del centro de ROI, como el borde del objeto o un lugar predeterminado fuera del objeto. Debido a este último, los perfiles de exploración de reloj de cada ROI siempre se pueden corregir por su fondo inmediato, lo que (en aplicaciones biológicas) hace que este perfil sea menos dependiente de no-uniformidad local, dentro de la muestra o de muestra a muestra En el etiquetado / tinción, así como la inestabilidadLa intensidad de la fuente de luz del microscopio o los tiempos de exposición a la luz fluorescente. El tamaño del objeto y la independencia de la forma de los perfiles de exploración de reloj amplían aún más el área de aplicación de este protocolo permitiendo la comparación de objetos diferentes, así como la corrección por punto a punto de sustracción de los perfiles de control "positivo" y "negativo" objetos.
Plugins de exploración de reloj: La principal limitación para distribuir y compartir el protocolo original era la dependencia de la plataforma de su código que se desarrolló con Visual Basic 6.0 (VB) 1 , 9 . Este problema ha sido abordado recientemente por uno de los grupos de investigación en el Instituto Leibniz de Farmacología Molecular, Alemania, mediante el desarrollo de una similar Fuji ImageJ Clock Scan plugin 2 . El plugin del Instituto Leibniz reproduce la funcionalidad básica de la exploración del reloj original en su capacidad de generarGral para el ROI de forma convexa cerrada, y además, puede procesar segmentos de contornos (arcos). Sin embargo, el límite de exploración del perfil generado por su complemento sólo se puede establecer en 100% (el borde del objeto), lo que significa que la intensidad del píxel de fondo no puede ser cuantificada. Además, no tiene capacidad para generar transformaciones polares, trabajar con diferentes canales de color en imágenes RGB, o trabajar con pilas de imágenes y procesar múltiples ROIs. En comparación, los dos nuevos complementos, descritos aquí, reproducen completamente la capacidad del código VB original ( es decir , la generación de perfiles de intensidad de píxeles de exploración de reloj integrados con visualización opcional de SD y / o sumación de fondo, así como el procesamiento de diferentes canales de color de Imágenes RGB). Además, pueden analizar un ROI de segmento / arco (funcionalidad introducida en el plugin Fuji ImageJ desarrollado en el Leibniz Institute of Molecular Pharmacology 2 ). Además, laEstos plugins amplían la utilidad de los programas anteriores generando transformaciones de imagen de ROI polares independientes del tamaño y de la forma del ROI, que pueden usarse en aplicaciones que requieren el registro de imágenes. Por último, el complemento de exploración de reloj múltiple facilita eficazmente la exploración de reloj de múltiples ROIs ubicados dentro de la misma imagen o en una pila de imágenes. Esta última característica del programa es especialmente útil en aplicaciones en las que es importante determinar los cambios relacionados con el tiempo y la ubicación.
Limitaciones y solución de problemas: La principal limitación del método Clock Scan es el requisito de seleccionar un ROI de forma convexa. El perfil de la exploración del reloj no tendría sentido en situaciones en las que cualquiera de las exploraciones radiales cruzan el esquema ROI más de una vez. Esto haría imposible la normalización de la longitud de tal exploración radial con respecto a la distancia desde el centro al borde de ROI. Otra limitación es que la información del perfil de exploración del reloj es progresEn ROI carente de simetría radial. Sin embargo, al menos en parte, estas dos limitaciones pueden superarse mediante el análisis de segmentos seleccionados (arcos) de ROI de forma compleja y asimétrica. El uso de la exploración de segmentos también se recomienda en los casos en que las secciones del territorio de fondo contienen características etiquetadas, que pueden afectar al procedimiento de resta de fondo (ver Figura 2A para un ejemplo de selección para el análisis de aquellos segmentos celulares que no se enfrentan a otras células marcadas). Por último, si se requiere el análisis de imágenes compuestas que contienen más de 3 canales de color, los canales de color de estas imágenes deben dividirse antes de ejecutar el complemento.
Direcciones futuras: La mejora futura en la funcionalidad de estos complementos incluirá, pero no se limitará a la actualización del código para combinar la funcionalidad de la exploración de reloj y complementos de exploración de reloj múltiple en un complemento. Algoritmos de co-localización de color (como algoritmosEd en los cálculos de la correlación de Pearson o coeficientes de división de Manders), y el desarrollo del plugin para ser capaz de trabajar con múltiples ROI que se seleccionan en diferentes imágenes o en diferentes rodajas en una pila de imágenes (versión actual de los plugins permite el análisis de varios ROIs seleccionados dentro de una imagen o un ROI seleccionado para todas las imágenes de la pila). Los autores también apreciarán cualquier sugerencia de los usuarios de plugins e informes de cualquier problema encontrado durante el uso de plugins existentes.
Conclusión: El análisis de reloj es una herramienta prometedora para estudios de imagenología en muchas áreas de la biología, desde el análisis del marcaje de células estáticas con varios marcadores hasta estudios de propagación de Na + o Ca ++ , dentro de una sola célula, Análisis de la propagación de la actividad ( por ejemplo , ondas Ca ++ ) en poblaciones de células sinápticamente conectadas 10 , 11 o las células acopladas a la unión de hueco 12 . Otras áreas potenciales de aplicación del análisis de reloj incluyen análisis de imagen médica (imágenes de ultrasonido de vasos sanguíneos, imágenes de TC y secciones transversales de hueso), astronomía (formación de imágenes en espiral y galaxia radial), química (difusión desde una fuente puntual) La física (análisis de patrones de difracción), la silvicultura (análisis del anillo de tallo de árbol para determinar la edad del árbol, así como períodos de tiempo seco y fertilización deficiente), ingeniería (corrosión de tubería metálica) y climatología.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Damos las gracias a la Dra. Tanja Maritzen y al Dr. Fabian Feutlinske (Instituto Leibniz de Farmacología Molecular, Berlín, Alemania) por compartir con nosotros su versión del complemento Fuji ImageJ Clock Scan e inspirarnos para desarrollar esta versión del programa. También estamos agradecidos al Dr. Fritz Melchers (Departamento de Desarrollo de Linfocitos, Instituto Max Planck por Biología de Infecciones) por su amable permiso para usar las imágenes de la base de datos de su departamento con el propósito de probar y mejorar el complemento. Apoyo: Centro de Neurociencias Translacionales; Beca NIH: P30-GM110702-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Any | compatible with software listed below | |
| ImageJ or Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/ | bundled with Java 1.8 or higher |
| Clock-scan plugins | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function |
References
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- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535 (2015).
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