转移因子的鉴定和表征转移到新的RIP 标签;tva小鼠模型
Summary
本文提出了一种利用 RIP 标记来演示一种新的体细胞基因转移系统的协议;tva小鼠模型研究基因在转移中的作用。禽病毒的 intracardiacally, 以确保基因转移到前, 无创性病变的胰β细胞在成年小鼠。
Abstract
转移性肿瘤占90% 的死亡患者的实体肿瘤。迫切需要更好地了解癌症转移的驱动因素, 并确定新的治疗靶点。为了研究推动从原发癌转移的分子事件, 我们开发了一个 bitransgenic 的小鼠模型, RIP 标签;RIP-tva。在这个老鼠模型中, 大鼠胰岛素启动子 (RIP) 驱动 SV40 T 抗原 (Tag) 和受体的表达的亚群 A 禽白血病病毒 (tva) 在胰腺β细胞。小鼠的胰腺神经内分泌肿瘤100% 显通过明确的阶段, 类似于人的肿瘤, 包括增生, 血管生成, 腺瘤, 和浸润性癌的阶段。因为RIP 标记;tva小鼠不发育转移性疾病, 促进转移的基因改变可以很容易地被识别出来。体细胞基因转移到 tva 表达, 增殖胰腺β前病变是通过心内注射的鸟类病毒窝藏期望的基因改变。#62 的效价; 1 x 108每毫升的感染单位被认为适合于体内感染。此外, 禽病毒可感染从肿瘤中提取的细胞系, 在RIP 标签;tva小鼠, 效率高。细胞系也可以用来表征转移的因素。在这里, 我们演示如何利用这种小鼠模型和细胞系来评估候选基因在肿瘤转移中的作用。
Introduction
大多数癌症都是由体细胞突变引起的1。传统的基因工程小鼠模型 (GEMM) 提供了重要的洞察力的贡献, 具体的基因改变的肿瘤发生的2。但是, 它们有几个限制。这些模型的主要缺点是, 它们不复制人类肿瘤形成的零星性质, 在这种情况下, 只有组织内的一些细胞才能获得基因改变。转基因和剔除小鼠的突变也系有可能影响发展。此外, 生成这些鼠标模型是昂贵和耗时的。
转移是一个重要的问题在癌症领域。模型转移在 GEMM 是困难的。小鼠自发转移是罕见的。显是可变的, 潜伏期很长, 在转移的 GEMM 3。实验性转移模型采用直接注射细胞进入小鼠的循环, 从而消除了转移级联的早期步骤。
为了克服在小鼠模型中研究转移因子的一些局限性, 我们开发了一个 bitransgenic 的鼠标模型, RIP 标签;RIP-tva4。该策略的基础是结合使用高度同步的肿瘤进展小鼠模型, RIP 标记5, 和受体的子群-禽白血病病毒, tva 6,7。此RIP 标记;RIP tva的鼠标模型允许基因被引入体细胞到一个单一的 bitransgenic 老鼠菌株。随着 SV40 T 抗原抑制 Rb 和 p53 的抑瘤作用, 小鼠的胰腺神经内分泌肿瘤与人的肿瘤形成相似, 包括增生、血管生成、腺瘤和浸润性癌。这个RIP 标签模型对我们了解癌症的特征非常有启发意义, 而不限于胰腺神经内分泌肿瘤。它也被用于临床前试验8。
我们提出了一个协议的体细胞基因转移通过注射禽病毒 intracardiacally 到RIP 标签;tva鼠标。成功的感染与 RCASBP 源性禽病毒需要积极增殖靶细胞。因此, 我们选择了RIP 标记;tva小鼠在7周的年龄, 当增生在约50% 的胰岛发育。需要高效价病毒的左心室心内注射, 以达到 10-20% 4的感染效率。这种传递方法减少病毒颗粒在传播到胰岛前的有效稀释。
使用这种方法, 我们以前已经证明, 亡促进肿瘤转移独立于其功能4,9。这种亡独立的转移功能没有观察到时, 通过转基因在所有的胰腺β细胞在整个瘤个体发育的RIP 标签;RIP-多 xL鼠标型号10。因此, 我们的鼠标模型提供了一个独特的机会, 以确定和表征基因的功能时, 表达的后期阶段的肿瘤。因为2-4% 的小岛发展成肿瘤在RIP 标签;tva bitransgenic 小鼠无病毒感染, 并非所有的前病灶都感染了 RCASBP 源性禽病毒, 只有具有选择性优势的因素才能确定肿瘤的自然病程。特别是, 转移因素将是最容易识别的这种方法, 因为转移到胰腺淋巴结或其他器官通常不会发生在RIP 标签;tva鼠标。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本研究中, 我们描述了一个强大的鼠标模型, RIP 标签;RIP-tva,通过禽病毒实现体细胞基因的传递, 以确定和鉴定转移因子。虽然RIP 标记;tva小鼠开发胰腺神经内分泌肿瘤, 在这种小鼠模型中发现的转移因子也可能促进其他癌症类型的转移。
我们的方法有优势, 引入体细胞遗传变化, 特别是前病变胰腺β细胞的控制方式, 从而更忠实地模仿偶发人类肿瘤的发展。这种方?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢哈罗德 Varmus, 布赖恩 c. 刘易斯, 道格拉斯 Hanahan, 丹尼黄, 沙龙庞, 梅根黄, 和玛纳斯河 m. 哥博利。y.c.n. D. 得到国防部 W81XWH-16-1-0619 和 NIH 补助金1R01CA204916 的支持。
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
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