Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, um eine neuartige somatische Gentherapie-Transfer-System unter Verwendung RIP-Tag zu demonstrieren; RIP-tva Maus-Modell für die Funktion von Genen in Metastasen zu untersuchen. Die Vogelgrippe Retroviren liefern wir Intracardiacally um Gentransfer in Pre-maligne, nicht-invasive Läsionen des Pankreas β-Zellen bei Erwachsenen Mäusen zu gewährleisten.
Abstract
Metastasiertem Krebs entfallen 90 % der Todesfälle bei Patienten mit soliden Tumoren. Es ist dringend notwendig, die Treiber von Krebsmetastasen besser zu verstehen und neue therapeutische Targets zu identifizieren. Um molekularen Ereignisse zu untersuchen, die das Fortschreiten von primären Krebs, Metastasen zu fahren, haben wir eine Bitransgenic-Maus-Modell, RIP-Tag entwickelt; RIP-tva. In diesem Mausmodell treibt die Ratte Insulin Promotor (RIP) Ausdruck der SV40 T-Antigen (Tag) und der Rezeptor für Untergruppe ein Virus der Vogelgrippe noch (tva) in pankreatische β-Zellen. Die Mäuse entwickeln neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse mit 100 % Penetranz durch klar definierte Stadien, die ähnlich wie menschliche Tumorgenese mit Stufen einschließlich Hyperplasie, Adenom, Angiogenese und invasives Karzinom. Weil RIP-Tag; RIP-tva Mäuse entwickeln keine Metastasen, genetische Veränderung, die Metastasierung fördern leicht identifizierbar. Somatische Gentransfer in tva exprimierenden, wuchernden pankreatische β prämaligne Läsionen durch intrakardiale Injektion von Vogelgrippe Retroviren beherbergen die gewünschte genetische Veränderung erreicht wird. Ein Titer von > 1 x 108 infektiösen Einheiten pro ml als angemessen für in-Vivo -Infektion angesehen. Darüber hinaus können Vogelgrippe Retroviren infizieren Zelllinien aus Tumoren in RIP-Tag; RIP-tva Mäuse mit hohem Wirkungsgrad. Die Zell-Linien können auch verwendet werden, metastasierendem Faktoren charakterisieren. Hier zeigen wir wie Sie nutzen dieses Mausmodell und Zell-Linien, um die Funktionen von Kandidatengenen im Tumor Metastasen zu beurteilen.
Introduction
Die meisten Krebsarten entstehen durch somatische Mutationen 1. Konventionelle gentechnisch veränderter Mausmodelle (GEMM) haben bedeutende Einblicke in den Beitrag von bestimmten genetischen Veränderungen, die auf Tumorgenese 2zur Verfügung gestellt. Sie haben jedoch mehrere Einschränkungen. Der größte Nachteil dieser Modelle ist, dass sie nicht die sporadische Natur der Tumorbildung im Menschen replizieren, in dem nur einige Zellen innerhalb eines Gewebes genetische Veränderungen erwerben. Die Mutationen in transgenen und Knockout-Mäuse sind auch Keimbahn mit auf die Entwicklung auswirken. Darüber hinaus ist erzeugen diese Maus-Modellen teuer und zeitaufwändig.
Metastasierung ist ein wichtiges Thema im Bereich der Krebs. Modellierung von Metastasen war schwierig in GEMM. Spontane Metastasierung ist selten in der Maus. Penetranz ist variabel und Latenz ist lang in GEMM Metastase 3. Experimentelle Metastasierung Modelle beschäftigen direkte Injektion von Zellen in den Blutkreislauf von Mäusen, so dass die ersten Schritte in der metastasierten Kaskade beseitigt werden.
Um einige der oben genannten Einschränkungen bei der Untersuchung von metastasierendem Faktoren in Mausmodellen zu überwinden, haben wir eine Bitransgenic-Maus-Modell, RIP-Tag entwickelt; RIP-tva4. Die Strategie basiert auf der Kombination der Verwendung von einem Mausmodell hoch synchronisiert Tumor Progression, RIP-Tag 5, und der Rezeptor für Vogelgrippe noch Untergruppe-A-Virus, tva 6,7. Dieses RIP-Tag; RIP-tvaMaus-Modell ermöglicht es Gene somatisch zu einem einzigen Bitransgenic Maus Stamm eingeführt werden. Mit dem SV40 T Antigen unterdrücken die Tumor unterdrückende Funktionen der Rb und p53 entwickeln Mäuse neuroendokrine Pankreastumoren in ähnlicher Weise zu menschlichen Tumorgenese mit Stufen einschließlich Hyperplasie, Adenom, Angiogenese und invasives Karzinom. Diese RIP-Tag -Modell wurde sehr lehrreich für unser Verständnis der Kennzeichen von Krebs, nicht beschränkt auf neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse. Es hat auch in präklinischen Studien 8eingesetzt.
Wir präsentieren ein Protokoll für somatische Gentransfer durch Injektion von Vogelgrippe Retroviren Intracardiacally in RIP-Tag; RIP-tva Mäuse. Erfolgreiche Infektion mit RCASBP-abgeleitete Geflügelpest Retroviren erfordert aktiv wuchernden Zielzellen. Daher wählten wir RIP-Tag; RIP-tva Mäuse 7 Wochen alt, wann Hyperplasie entwickelt sich bei etwa 50 % von den pankreatischen kleinen Inseln. Linke ventrikuläre intrakardiale Injektion von hohen Titer Viren ist erforderlich, um eine Infektion Wirkungsgrad von 10-20 % 4. Diese Lieferung Methode reduziert die signifikante Verdünnung der Viruspartikel im Umlauf bevor Viren pankreatische kleinen Inseln erreichen.
Mit diesem Ansatz haben wir bereits gezeigt, dass Bcl-xL Krebsmetastasen unabhängig von seinen Anti-Apoptotic Funktion 4,9 fördert. Diese Anti-apoptotische unabhängig metastasierendem Funktion wurde nicht beobachtet, wenn Bcl-xL über ein Transgen in allen pankreatische β-Zellen im gesamten tumorigenic Ontogenese in der RIP-Tag zum Ausdruck kam; RIP-Bcl-xL Maus Modell 10. Deshalb bietet unsere Maus-Modell eine einmalige Gelegenheit, zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene Funktionen ausgedrückt in einem späteren Stadium der Tumorgenese. Denn 2-4 % der Inseln entwickeln sich zu Tumoren in der RIP-Tag; RIP-tva Bitransgenic Mäuse ohne Virusinfektion und nicht alle prämaligne Läsionen mit der RCASBP abgeleitete Geflügelpest Retroviren infiziert sind, nur die Faktoren, die einen selektiven Vorteil über den natürlichen Verlauf der Tumorgenese konferieren identifiziert werden können. Insbesondere werden metastasierendem Faktoren am leichtesten durch diese Methode erkannt werden, weil Metastasen in Pankreas Lymphknoten oder anderen Organen nicht normalerweise in RIP-Tag tritt; RIP-tva Mäuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir eine mächtige Maus-Modell, RIP-Tag beschrieben; RIP-tva, , somatische Gentherapie Lieferung über Vogelgrippe Retroviren zur Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren zu erreichen. Obwohl RIP-Tag; RIP-tva Mäuse entwickeln neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse, metastasierendem Faktoren identifiziert in diesem Mausmodell können auch Metastasen von anderen Krebsarten fördern.
Unser Ansatz hat den Vorteil der Einf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong und Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. stützt sich auf DOD Grant W81XWH-16-1-0619 und NIH Grant 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
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