Identificatie en karakterisering van metastatische factoren door genenoverdracht in de roman RIP-Tag; RIP-BTW lymfkliertest Model
Summary
We presenteren een protocol om aan te tonen van een roman somatic gene transfersysteem met behulp van RIP-Tag; RIP-BTW muismodel om te bestuderen van de functie van genen in metastase. De aviaire retrovirussen zijn intracardiacally om ervoor te zorgen genenoverdracht in pre-maligne, noninvasive laesies van de cellen van de alvleesklier β in volwassen muizen geleverd.
Abstract
Metastatische kanker is verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen bij patiënten met solide tumoren. Er is een dringende noodzaak om de bestuurders van uitzaaiing van kanker beter te begrijpen en te identificeren van nieuwe therapeutische doelen. Voor het onderzoek naar de moleculaire gebeurtenissen die de progressie van de primaire kanker naar metastase rijden, hebben we een muismodel van bitransgenic, RIP-Tag; RIP-BTW. In dit muismodel drijft de rat insuline promotor (RIP) de uitdrukking van het antigeen SV40 T (Tag) en de receptor voor deelgroep een virus van aviaire leukose (tva) in de alvleesklier β-cellen. De muizen ontwikkelen alvleesklier neuro-endocriene tumoren met 100% doordringendheid door duidelijk omschreven fasen die vergelijkbaar met menselijke tumorvorming, met stadia zijn, met inbegrip van hyperplasie, angiogenese, adenoom en carcinoom invasief. Omdat RIP-Tag; RIP-BTW muizen niet gemetastaseerde ziekte ontwikkelen, genetische wijzigingen die bevordering van metastase kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Somatic gene transfer in het tva-uiten, alvleesklier β prolifererende Premaligne laesies is bereikt door middel van intracardiac injectie van aviaire retrovirussen herbergen de gewenste genetische wijziging. Een titer van > 1 x 108 besmettelijke eenheden per ml is geschikt geacht voor in vivo infectie. Daarnaast kunnen aviaire retrovirussen infecteren cellijnen afgeleid van tumoren in RIP-Tag; RIP-BTW muizen met een hoog rendement. De cellijnen kunnen ook worden gebruikt om te karakteriseren de metastatische factoren. Hier laten we zien hoe deze muismodel gebruiken en cellijnen om te beoordelen van de functies van kandidaat-genen in de uitzaaiing van de tumor.
Introduction
De meeste kankers ontstaan van somatische mutaties 1. Conventionele genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMM) hebben belangrijke inzichten in de bijdrage van specifieke genetische wijzigingen op tumorvorming 2verstrekt. Zij hebben echter verschillende beperkingen. Het grote nadeel van deze modellen is dat ze niet de sporadische aard van tumor vorming bij de mens, waarin slechts sommige cellen binnen een weefsel genetische wijzigingen verwerven repliceren. De mutaties in transgene en knockout muizen zijn ook germline met potentieel tot ontwikkeling beïnvloeden. Bovendien, het genereren van deze Muismodellen is duur en tijdrovend.
Metastase is een belangrijke kwestie op het gebied van kanker. Modelleren van metastase moeizaam in GEMM. Spontane metastase is zeldzaam in de muis. Doordringendheid is variabel en latentie is lang in GEMM van metastase 3. Experimentele metastase modellen dienst directe injectie van cellen in de circulatie van muizen, zodat de eerste stappen in de gemetastaseerde opeenvolging worden geëlimineerd.
Om te overwinnen sommige van de bovenstaande beperkingen in het bestuderen van metastatische factoren in muismodellen, hebben we een muismodel van bitransgenic, RIP-Tag; RIP-BTW4. De strategie is gebaseerd op de combinatie van het gebruik van een sterk gesynchroniseerd tumor progressie muismodel, RIP-Tag 5, en de receptor voor aviaire leukose deelgroep-A virus, tva 6,7. Deze RIP-Tag; RIP-BTWmuismodel kunt genen somatically worden ingevoerd in een interne bitransgenic muis stam. Met het onderdrukken van de tumor onderdrukkende functie van Rb en p53 SV40 T-antigeen ontwikkelen muizen alvleesklier neuro-endocriene tumoren in een soortgelijke wijze als menselijke tumorvorming, met stadia, met inbegrip van hyperplasie, angiogenese, adenoom en carcinoom invasief. Dit model van de RIP-Tag is zeer leerzaam voor ons begrip van de kenmerken van de kanker, niet beperkt tot de alvleesklier neuro-endocriene tumoren. Het is ook gebruikt in preklinische proeven 8.
Presenteren we een protocol voor somatische genenoverdracht via injectie van aviaire retrovirussen intracardiacally in RIP-Tag; RIP-BTW muizen. Succesvolle besmetting met aviaire retrovirussen RCASBP afkomstige vereist actief delende cellen van de doelgroep. Daarom kozen we voor RIP-Tag; RIP-BTW muizen op 7 weken van leeftijd, wanneer hyperplasie in ongeveer 50% van de alvleesklier eilandjes ontwikkelt. Linker ventriculaire intracardiac injectie van hoge titer virussen is vereist om de efficiëntie van een infectie van 10-20% 4te bereiken. Deze leveringsmethode vermindert de significante verdunning van virale deeltjes binnen verkeer voordat virussen alvleesklier eilandjes bereiken.
Met behulp van deze aanpak, hebben wij eerder aangetoond dat Bcl-xL kanker uitzaaiingen onafhankelijk van haar anti-apoptotic functie 4,9 bevordert. Deze anti-apoptotic-onafhankelijke metastatische functie werd niet waargenomen als Bcl-xL was uitgedrukt via een transgenic in alle alvleesklier β-cellen in de hele tumorigene ontogenie in de RIP-Tag; RIP-Bcl-xL muis model 10. Daarom biedt onze muismodel een unieke gelegenheid om te identificeren en te karakteriseren genen functies als uitgedrukt in een later stadium van tumorvorming. Omdat 2-4% van de eilandjes uitgroeien tot tumoren in de RIP-Tag; RIP-BTW bitransgenic Muizen zonder virale infectie en niet alle de Premaligne laesies zijn besmet met de RCASBP-afgeleide aviaire retrovirussen, alleen de factoren die een selectief voordeel bieden in de natuurlijke loop van tumorvorming kunnen worden geïdentificeerd. Metastatische factoren met name zal gemakkelijkst worden herkend door deze methode, omdat metastase aan alvleesklier lymfeklieren of andere organen normaal gesproken niet in RIP-Tag treedt; RIP-BTW muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschreven we een krachtige muismodel, RIP-Tag; RIP-tva, om de somatische gene levering via aviaire retrovirussen voor de identificatie en karakterisering van metastatische factoren. Hoewel RIP-Tag; RIP-BTW muizen alvleesklier neuro-endocriene tumoren ontwikkelen, metastatische factoren geïdentificeerd in het muismodel van deze ook uitzaaiingen van andere soorten kanker kunnen bevorderen.
Onze aanpak heeft het voordeel van de invoering van somatische genetisch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong en Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. wordt ondersteund door DOD grant W81XWH-16-1-0619 en NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
