Identificazione e caratterizzazione di fattori metastatici di trasferimento genico nel romanzo RIP-Tag; RIP-tva modello murino
Summary
Vi presentiamo un protocollo per dimostrare un sistema di trasferimento di romanzo genica somatica che utilizza RIP-Tag; RIP-tva modello di topo per studiare la funzione dei geni in metastasi. Il retrovirus aviaria vengono consegnati intracardiacally per garantire il trasferimento genico in lesioni pre-maligne, non invasive delle cellule β del pancreas in topi adulti.
Abstract
Cancro metastatico è responsabile del 90% dei decessi nei pazienti con tumori solidi. C’è un urgente bisogno di comprendere meglio i driver della metastasi del cancro e di identificare nuovi bersagli terapeutici. Per studiare gli eventi molecolari che determinano la progressione dal cancro primario alla metastasi, abbiamo sviluppato un modello murino di bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva. In questo modello del topo, il promotore di insulina di ratto (RIP) unità, l’espressione dell’antigene T di SV40 (Tag) e il recettore per il sottogruppo un virus della leucosi aviaria (tva) nelle cellule β del pancreas. I topi sviluppano tumori neuroendocrini pancreatici con penetranza del 100% attraverso fasi ben definite che sono simili alla tumorigenesi umana, con le fasi compreso l’iperplasia, l’angiogenesi, l’adenoma e carcinoma invasivo. Perché RIP-Tag; RIP-tva topi non sviluppano la malattia metastatica, alterazioni genetiche che promuovono le metastasi possono essere identificate facilmente. Genica somatica trasferire in tva-esprimendo, proliferando β pancreatiche lesioni premaligne avviene attraverso iniezione intracardiaca di aviaria retrovirus che harboring l’alterazione genetica desiderata. Un titolo di > 1 x 108 unità infettive per ml è considerato appropriato per l’infezione in vivo . Inoltre, retrovirus aviaria può infettare linee cellulari derivate da tumori in RIP-Tag; RIP-tva topi con alta efficienza. Le linee cellulari è utilizzabile anche per caratterizzare i fattori metastatici. Qui dimostriamo come utilizzare questo modello di mouse e di cellula per valutare le funzioni di geni candidati in metastasi del tumore.
Introduction
Maggior parte dei tumori derivano da mutazioni somatiche 1. Modelli convenzionali e geneticamente costruito del topo (GEMM) hanno fornito notevoli intuizioni il contributo di specifiche alterazioni geniche alla tumorigenesi 2. Tuttavia, essi hanno diverse limitazioni. Lo svantaggio principale di questi modelli è che essi non replicare la natura sporadica di formazione del tumore in esseri umani, in cui solo alcune cellule all’interno di un tessuto acquisiscono alterazioni genetiche. Le mutazioni in topi transgenici e knockoui sono anche germinale con potenziale per influenzare lo sviluppo. Inoltre, generare questi modelli murini è costoso e richiede tempo.
Metastasi è un problema significativo nel campo del cancro. Metastasi di modellazione è stato difficile in GEMM. La metastasi spontanea è rara nel topo. La penetranza è variabile e la latenza è lungo in GEMM di metastasi 3. Metastasi sperimentale modelli impiegano iniezione diretta delle cellule nella circolazione dei topi, così i primi passi in cascata metastatica sono stati eliminati.
Per superare alcune delle limitazioni di cui sopra nello studiare fattori metastatici in modelli murini, abbiamo sviluppato un modello murino di bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva4. La strategia si basa sulla combinazione tra l’uso di un modello murino di progressione del tumore altamente sincronizzato, RIP-Tag 5e il recettore per il virus della leucosi aviarie sottogruppo-A, tva 6,7. Questo RIP-Tag; RIP-tvamodello del mouse permette di geni ad essere introdotti somatico in un ceppo di topo bitransgenic singolo. Con l’antigene T di SV40 sopprimere le funzioni soppressiva del tumore di Rb e p53, i topi sviluppano i tumori neuroendocrini del pancreas in modo simile alla tumorigenesi umana, con le fasi compreso l’iperplasia, l’angiogenesi, l’adenoma e carcinoma invasivo. Questo modello RIP-Tag è stato molto istruttivo per la nostra comprensione dei segni distintivi di cancro, non limitato ai tumori neuroendocrini pancreatici. È stato utilizzato anche in studi preclinici 8.
Vi presentiamo un protocollo per il trasferimento di genica somatica attraverso iniezione di aviaria retrovirus intracardiacally in RIP-Tag; RIP-tva topi. Infezione successo con RCASBP-derivato aviaria retrovirus richiede attivamente proliferanti cellule bersaglio. Pertanto, abbiamo scelto RIP-Tag; RIP-tva topi a 7 settimane di età, quando l’iperplasia si sviluppa in circa il 50% degli isolotti pancreatici. Iniezione intracardiaca ventricolare sinistra di virus di alto titolo è necessaria per raggiungere un’efficienza di infezione del 10-20% 4. Questo metodo di consegna riduce la diluizione significativa di particelle virali all’interno di circolazione prima virus raggiungere isolotti pancreatici.
Utilizzando questo approccio, abbiamo precedentemente dimostrato che Bcl-xL promuove la metastasi del cancro indipendente della sua funzione anti-apoptotica 4,9. Questa funzione di anti-apoptotici-indipendente metastatica non è stata osservata quando Bcl-xL è stato espresso tramite un transgene in tutte le cellule β del pancreas nel corso dell’ontogenesi cancerogeno in RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mouse modello 10. Di conseguenza, il nostro modello di mouse offre un’opportunità unica di identificare e caratterizzare le funzioni dei geni quando espresso in una fase successiva della tumorigenesi. Perché 2-4% degli isolotti svilupparsi in tumori in RIP-Tag; RIP-tva bitransgenic topi senza infezione virale e non tutte le lesioni premaligne sono infettati con il retrovirus aviaria RCASBP-derivato, possono essere identificati soltanto i fattori che conferiscono un vantaggio selettivo nel corso naturale della tumorigenesi. In particolare, fattori metastatici saranno più facilmente riconosciuti da questo metodo, perché la metastasi ai linfonodi pancreatici o altri organi non si verifica normalmente in RIP-Tag; RIP-tva topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo descritto un modello di topo potente, RIP-Tag; RIP-tva, per realizzare la consegna genica somatica via aviaria retrovirus per l’identificazione e la caratterizzazione di fattori metastatici. Anche se RIP-Tag; RIP-tva topi sviluppano tumori neuroendocrini pancreatici, metastatici fattori identificati in questo modello di mouse possono anche promuovere le metastasi di altri tipi di cancro.
Il nostro approccio ha il vantaggio di introdurre cambiamenti g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong e Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. è supportato da DOD grant W81XWH-16-1-0619 e NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
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