Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino
Summary
Presentamos un protocolo para demostrar un sistema de transferencia génica somática novela utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo de ratón para estudiar la función de genes en la metástasis. El retrovirus aviares se entregan intracardiacally para asegurar la transferencia de genes en las lesiones premalignas, no invasivas de las células β pancreáticas en ratones adultos.
Abstract
Cáncer metastásico representa el 90% de las muertes en pacientes con tumores sólidos. Hay una necesidad urgente de entender mejor las causas de la metástasis del cáncer e identificar nuevas dianas terapéuticas. Para investigar los eventos moleculares que conducen a la progresión de cáncer primario a metástasis, hemos desarrollado un modelo de ratón de Alfredo, RIP-Tag; RIP-tva. En este modelo de ratón, el promotor de la insulina de rata (RIP) conduce la expresión del antígeno T de SV40 (Tag) y el receptor para el subgrupo un virus de la leucosis aviar (tva) en las células β pancreáticas. Los ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos con penetrancia de 100% a través de etapas bien definidas que son similares a la tumorigénesis humana, con etapas incluyendo hiperplasia, angiogénesis, adenoma y carcinoma invasor. Porque RIP-Tag; RIP-tva ratones no desarrollan enfermedad metastásica, alteraciones genéticas que promueven la metástasis pueden ser identificados fácilmente. Transferencia génica somática en tva-expresar, proliferando β pancreática las lesiones premalignas se logra a través de la inyección intracardiaca de retrovirus aviares que la alteración genética deseada. Un título de > 1 x 108 unidades infecciosas por ml se considera apropiado para la infección en vivo . Además, retrovirus aviares pueden infectar líneas celulares derivadas de tumores en RIP-Tag; RIP-tva ratones con alta eficiencia. Las líneas celulares también pueden utilizarse para caracterizar los factores metastáticos. Aquí se demuestra cómo utilizar este modelo de ratón y líneas para evaluar las funciones de genes candidatos en metástasis de tumor de la célula.
Introduction
Mayoría de los cánceres se deben a mutaciones somáticas 1. Modelos de ratón modificados genéticamente convencional (GEMM) han proporcionado penetraciones importantes en la contribución de las alteraciones genéticas específicas en tumorigenesis 2. Sin embargo, tienen varias limitaciones. El mayor inconveniente de estos modelos es que no replican la naturaleza esporádica de la formación de tumores en seres humanos, en el que sólo algunas células en un tejido adquirirán alteraciones genéticas. Las mutaciones en ratones transgénicos y knockout son germinales con potencial de afectar el desarrollo. Por otra parte, generar estos modelos de ratón es costoso y desperdiciador de tiempo.
La metástasis es un problema importante en el campo del cáncer. Modelado de metástasis ha sido difícil en GEMM. La metástasis espontánea es rara en el ratón. Penetrancia es variable y latencia es largo en GEMM de metástasis 3. Metástasis experimentales modelos utilizan la inyección directa de células en la circulación de ratones, por lo que se eliminan los primeros pasos en la cascada metastásica.
Para superar algunas de las limitaciones en el estudio de factores metastásicos en modelos de ratón, hemos desarrollado un modelo de ratón de Alfredo, RIP-Tag; RIP-tva4. La estrategia se basa en combinar el uso de un modelo del ratón de la progresión del tumor altamente sincronizada, RIP-Tag 5y el receptor para el virus de la leucosis aviar subgrupo-A, tva 6,7. Esta etiqueta de RIP ; RIP-tvamodelo de ratón permite genes a introducirse somáticamente en una cepa de ratón Alfredo sola. Con el antígeno T de SV40 suprime las funciones supresora de tumor de Rb y p53, ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos en una manera similar a la tumorigénesis humana, con etapas incluyendo hiperplasia, angiogénesis, adenoma y carcinoma invasor. Este modelo de Etiqueta de corte ha sido muy instructivo para la comprensión de las características distintivas del cáncer, no limitado a tumores neuroendocrinos pancreáticos. También se ha utilizado en ensayos preclínicos 8.
Presentamos un protocolo para la transferencia génica somática a través de la inyección de intracardiacally de retrovirus aviar en RIP-Tag; RIP-tva ratones. Exitosa infección con retrovirus aviares RCASBP derivados requiere activamente proliferante de las células diana. Por lo tanto, elegimos RIP-Tag; RIP-tva ratones en 7 semanas de edad, cuando la hiperplasia se desarrolla en aproximadamente el 50% de los islotes pancreáticos. Inyección intracardiaca ventricular izquierdo de virus de alto título es necesaria para lograr una eficiencia de infección del 10-20% 4. Este método reduce la dilución significativa de partículas virales en circulación antes de virus lleguen a islotes pancreáticos.
Usando este acercamiento, previamente hemos demostrado que Bcl-xL promueve la metástasis del cáncer independiente de su anti-apoptotic función 4,9. Esta función de anti-apoptosis-independiente metastásica no se observó cuando Bcl-xL se expresa a través de un transgén en todas las células β pancreáticas a lo largo de la ontogenia tumorígeno en RIP-Tag; RIP-Bcl-xL ratón modelo 10. Por lo tanto, nuestro modelo de ratón ofrece una oportunidad única de identificar y caracterizar las funciones de genes cuando se expresa en una etapa posterior de tumorigénesis. Porque 2-4% de los islotes se convierten en tumores en la RIP-Tag; RIP-tva Alfredo ratones sin infección viral y no todas las lesiones premalignas son infectados con el retrovirus aviares derivado de RCASBP, pueden identificar solamente los factores que confieren una ventaja selectiva sobre el curso natural de la tumorigénesis. En particular, factores metastáticos serán más fácilmente reconocidos por este método, debido a metástasis a ganglios linfáticos pancreáticos o de otros órganos no ocurre normalmente en RIP-Tag; RIP-tva ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos descrito un modelo de ratón poderoso, RIP-Tag; RIP-tva, lograr el parto génica somática mediante retrovirus aviares para la identificación y caracterización de factores metastáticos. Aunque RIP-Tag; RIP-tva ratones desarrollan tumores neuroendocrinos pancreáticos, metástasis factores identificados en este modelo de ratón también pueden promover la metástasis de otros tipos de cáncer.
Nuestro enfoque tiene la ventaja de introducir cambios gen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong y Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. es apoyado por subvenciones de DOD W81XWH-16-1-0619 y NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
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