Na Vivo Imagem de Cx3cr1gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia
Summary
Este protocolo descreve técnicas como de alta resolução de imagem como tomografia de coerência óptica de domínio espectral e digitalização laser Oftalmoscopia pode ser utilizado em pequenos roedores, usando um sistema de plataforma de imagem oftálmica, para obter informações sobre espessura da retina e microglial celular distribuição, respectivamente.
Abstract
Tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) e digitalização Oftalmoscopia do laser (SLO) são usados extensivamente em oftalmologia experimental. No presente protocolo, camundongos expressando verde proteína fluorescente (gfp) sob o promotor da Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) foram usados para imagem microglia células na vivo na retina. Microglia são macrófagos residentes da retina e têm sido implicados em várias doenças da retina1,2,3,4,5,6. Este protocolo fornece uma abordagem detalhada para geração de B-retina, com SD-OCT e imagem latente de distribuição de célula microglia em camundongos Cx3cr1gfp/gfp com SLO na vivo, usando um sistema de plataforma de imagem oftálmica. O protocolo pode ser usado em várias linhas de rato de repórter. No entanto, existem algumas limitações do protocolo aqui apresentado. Em primeiro lugar, ambos SLO e SD-OCT, quando usado no modo de alta resolução, coletar dados com alta resolução axial, mas a resolução lateral são mais baixos (3,5 µm e 6 µm, respectivamente). Além disso, o nível de saturação e foco em SLO é altamente dependente da seleção do parâmetro e o alinhamento correcto do olho. Além disso, usar dispositivos projetados para pacientes humanos em ratos é desafiador, devido a maior potência óptica total do olho do rato comparado ao olho humano; Isso pode levar a lateral ampliação imprecisões7, que também são dependentes a ampliação pela lente do mouse entre outros. No entanto, apesar de que a tomografia axial posição é dependente da ampliação lateral, as medições de SD-OCT axiais são precisos8.
Introduction
Na oftalmologia experimental, exame de patologia retiniana geralmente é avaliada usando técnicas histológicas. No entanto, histologia requer a eutanásia de animais e pode causar alteração para as propriedades reais do tecido. SD-OCT e SLO são rotineiramente usados em oftalmologia clínica para fins de diagnóstico e de acompanhamento de diversas doenças da retina como edema macular diabético9, neuropatia óptica isquêmica anterior10ou retinite pigmentosa11 . SD-OCT e SLO são técnicas não-invasivas que geram imagens de alta resolução da retina, que são visualizadas através da pupila dilatada sem mais intervenção. SD-OCT fornece informações da estrutura da retina e da espessura da retina através da recolha de dados Retrodispersão para criar imagens transversais da retina, enquanto SLO coleta dados de fluorescência para produzir imagens estereoscópicas de alto contraste da retina. Hoje em dia, ambas as técnicas são cada vez mais utilizadas em oftalmologia experimental usando pequenos roedores12,13,14,15 (ou mesmo zebrafish16,17) e pode fornece tanto informações qualitativas e quantitativas12,17,18,19,20,21.
Acumulação de fluorophores endógena como lipofuscins ou a formação de drusen na retina pode ser visualizada por SLO como sinal fluorescente auto. Esta característica torna SLO uma técnica valiosa para diagnóstico e monitoramento de doenças da retina como a degeneração macular relacionada à idade ou retinite pigmentosa22,23. Na oftalmologia experimental, fluorescência de auto imagem (AF) pode ser usada para a detecção de tipos de células específicas em linhas de rato de repórter. Por exemplo, ratos heterozigotos para a expressão de gfp sob o promotor de Cx3cr124 são vantajosos para visualização no vivo das pilhas microglial na retina normal e para a investigação de micróglia/macrófago dinâmica na doença da retina,21. Microglia são os macrófagos residentes da retina, que desempenham um papel fundamental na homeostase do tecido e reparação dos tecidos após lesão1,25,26. Ativação da microglia na retina tem sido relatada em degeneração, sugerindo um papel dessas células na doença da retina,2,3,4,5, , isquemia e lesão da retina 6.
O objectivo do presente protocolo é descrever um método relativamente simples para a imagem da retina e medição de espessura da retina usando SD-OCT e para visualização de células de gfp microglia positivo no rato retina utilizando Cx3cr1gfp/gfp SLO (sistema Heidelberg Spectralis HRA + OCT). Este protocolo pode ser utilizado para medições de imagem e espessura da retina saudável ou doente em várias linhas de rato. Além disso, as análises morfométricas podem ser realizadas para a identificação e quantificação de números microglia e ativação da microglia na retina usando SLO21. As células da micróglia são associadas com doenças degenerativas no sistema nervoso central (CNS), incluindo a retina27,28,29. Assim, combinando os dois métodos utilizados no presente protocolo, pode ser feita correlação de distribuição microglia e degeneração da retina, que pode facilitar o monitoramento severidade da doença ou a eficácia da terapêutica se aproxima na vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente artigo demonstra um protocolo para a aquisição de B-retina e a imagem latente de gfp microglia positiva distribuição na retina do rato na mesma sessão de imagens. SD-OCT e SLO são cada vez mais usados em modelos animais de doença da retina para fornecer informações de alterações da retina ao longo do tempo,10,14,17,18,21. Com este protoco…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um subsídio da Swiss National Science Foundation (SNSF; #320030_156019). Os autores receberam apoio financeiros Heidelberg Engineering GmBH, Alemanha.
Materials
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
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