En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser
Summary
Este protocolo describe cómo alta resolución técnicas imagenológicas como una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser puede ser utilizada en pequeños roedores, utilizando un sistema de plataforma imagen oftálmica, para obtener información sobre espesor retiniano y microglía células distribución, respectivamente.
Abstract
Tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) y exploración oftalmoscopia de láser (SLO) son ampliamente utilizados en Oftalmología experimental. En el presente Protocolo, los ratones que expresaban verde proteína fluorescente (gfp) bajo el promotor de Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) fueron utilizados para una imagen de microglia células en vivo en la retina. Microglia son macrófagos residentes de la retina y han sido implicados en varias enfermedades de la retina1,2,3,4,5,6. Este protocolo proporciona un enfoque detallado para la generación de retina B-SCAN, con SD-OCT y proyección de imagen de la distribución de células de la microglia en ratones Cx3cr1gfp/gfp con SLO en vivo, utilizando un sistema de plataforma de imagen oftálmica. El protocolo puede utilizarse en varias líneas de ratón reportero. Sin embargo, existen algunas limitaciones en el protocolo presentado aquí. En primer lugar, SLO tanto SD-OCT, cuando se utiliza en el modo de alta resolución, recogemos datos con alta resolución axial, pero la resolución lateral son menores (3,5 μm y 6, respectivamente). Por otra parte, el nivel de enfoque y saturación en SLO es altamente dependiente de la selección de parámetros y la correcta alineación de los ojos. Además, uso de dispositivos diseñados para pacientes humanos en ratones es difícil debido al mayor poder óptico total del ojo de ratón en comparación con el ojo humano; Esto puede conducir al lateral aumento inexactitudes7, que también son dependientes en la magnificación de la lente del ratón entre otros. Sin embargo, a pesar de que la exploración axial posición depende del aumento lateral, las medidas de SD-OCT axiales son precisas8.
Introduction
En la oftalmología experimental, examen de patología retiniana se evalúa generalmente utilizando técnicas histológicas. Sin embargo, la histología requiere euthanization animal y puede causar alteración de las propiedades reales del tejido. SD-OCT y SLO se utilizan habitualmente en Oftalmología Clínica para el diagnóstico y para el control de varias enfermedades de la retina como el edema macular diabético9, neuropatía óptica isquémica anterior10o retinitis pigmentosa11 . SD-OCT y SLO son técnicas no invasivas que generan imágenes de alta resolución de la retina, que se visualizan a través de la pupila dilatada sin otra intervención. SD-OCT proporciona información de la estructura retiniana y grueso retiniano por la recogida de datos de retrodispersión para crear imágenes transversales de la retina, mientras que SLO recoge datos de fluorescencia para producir imágenes estereoscópicas de alto contraste de la retina. En la actualidad, ambas técnicas son cada vez más utilizados en Oftalmología experimental con roedores pequeños12,13,14,15 (o incluso de16,de pez cebra17) y puede proporcionar tanto información cualitativa y cuantitativa12,17,18,19,20,21.
Acumulación de fluoróforos endógenos como el lipofuscins o la formación de drusas en la retina puede ser visualizada por SLO como señal fluorescente auto. Esta característica hace que SLO una técnica valiosa para diagnóstico y seguimiento de enfermedades retinianas como la degeneración macular o retinosis pigmentaria22,23. En la oftalmología experimental, fluorescencia automático (AF) la proyección de imagen puede utilizarse para la detección de tipos de células específicos en líneas de ratón reportero. Por ejemplo, los ratones heterocigotos para la expresión de gfp bajo el promotor de Cx3cr124 son ventajosas para la visualización en vivo de las células microgliales en la retina normal y para la investigación de microglia/macrófagos dinámica de la enfermedad retiniana21. Microglia son los macrófagos residentes de la retina, que juegan un papel fundamental en la homeostasis del tejido y reparación del tejido con lesión1,25,26. Activación de la microglia en la retina se ha divulgado en lesiones de retina, isquemia y degeneración, sugiriendo un papel de estas células en la enfermedad retiniana2,3,4,5, 6.
El objetivo del presente Protocolo es describir un método relativamente simple para la medición del espesor retiniano con SD-OCT y la proyección de imagen retiniana y para la visualización de gfp positivas microglía las células en la retina de ratón Cx3cr1gfp/gfp utilizando SLO (sistema de Heidelberg Spectralis HRA + OCT). Este protocolo puede ser utilizado para medir la proyección de imagen y el grosor de retinas sanas o enfermas en varias líneas de ratón. Además, pueden realizarse análisis morfométricos para la identificación y cuantificación de números de microglia y activación de la microglia en la retina con SLO21. Las células de la microglia se asocian con enfermedades degenerativas de sistema nervioso central (SNC), incluyendo la retina27,28,29. Así, combinando los dos métodos utilizados en el presente Protocolo, correlación de la distribución de la microglía y degeneración retiniana se puede hacer, que puede facilitar el monitoreo severidad de la enfermedad o la efectividad de la terapéutica aproxima en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente artículo muestra un protocolo para la adquisición de B-SCAN retiniana y la proyección de imagen de gfp distribución de positivo de la microglia en la retina de ratón en la misma sesión de proyección de imagen. SD-OCT y SLO utilizan cada vez más en modelos animales de enfermedad retiniana para proporcionar información de las alteraciones retinianas por tiempo10,14,17,18…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de ciencia nacional suizo (FNS; 320030_156019 #). Los autores recibieron apoyo no financiero de Heidelberg Engineering GmBH, Alemania.
Materials
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
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