Summary

Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central

Published: August 25, 2017
doi:

Summary

Méthodes pour une livraison de gène à grande échelle du système nerveux central chez le rat sont couvertes. Dans cet exemple, le but consiste à mimer une maladie qui affecte l’ensemble de la moelle épinière. La transduction généralisée peut être utilisée pour fournir une protéine thérapeutique à la CNS d’une administration unique, périphérique.

Abstract

Vecteurs de virus adeno-associated virus (AAV) sont un réactif clé en neurosciences pour groupés régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR), optogenetics, ciblant les cre-lox, etc.. Le but de ce manuscrit est d’aider le chercheur tente expansive du système nerveux central (CNS) transfert de gènes chez le rat par injection dans la veine queue d’AAV. Grande échelle expression s’applique pour les conditions avec une pathologie très répandue, et un modèle de rat est important en raison de sa grande taille et similarités physiologiques à l’homme par rapport à des souris. Dans cet exemple d’application, une transduction neuronale à grande échelle est utilisée pour simuler une maladie neurodégénérative qui affecte l’ensemble de la moelle épinière, sclérose latérale amyotrophique (SLA). La transduction de CNS grande échelle efficace permet également de livrer des facteurs protéiques thérapeutiques dans des études précliniques. Après un intervalle d’expression après l’injection de plusieurs semaines, les effets de la transduction sont évalués. Pour un vecteur de contrôle de la protéine fluorescente verte (GFP), la quantité de GFP dans le cervelet est estimée rapidement et sûrement par un programme d’imagerie de base. Pour les phénotypes maladie moteur qui sont induits par l’ALS concernant réponse transactive protéine protéine de liaison à l’ADN de 43 kDa (TDP-43), les déficits sont marqués par rotarod et réflexe de fuite. Au-delà de la modélisation de la maladie et la thérapie génique, il y a diverses applications potentielles pour le ciblage de gène de grande échelle décrite ici. L’utilisation accrue de cette méthode aidera à accélérer dans les neurosciences et la neurogénétique des tests d’hypothèses.

Introduction

Vecteurs recombinants adeno-associated virus (AAV) sont des outils indispensables pour la recherche de la CNS, parce qu’ils sont si efficaces pour la transduction des neurones in vivo. Des vecteurs d’AAV sont très versatiles pour étudier différents transgènes et isoformes protéiques, différents tissus, différentes espèces hôtes et les différentes voies d’administration. Par exemple, AAV peut être administré à des souris par un périphérique, peu intrusive, injection intraveineuse pour transmettre les neurones dans le système nerveux central comme le premier décrit dans Foust et coll. et Duque et al. (voir le document JOVE par Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 approche de prestation de ce gène est utilisée chez les rats d’exprimer efficacement une protéine fluorescente verte (GFP) ou l’ALS associés protéine, réponse transactive ADN-protéine de 43 kDa (TDP-43) dans le système nerveux central. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 travailler chez le rat est important car les paramètres physiologiques et métaboliques de la rat sont plus proches de l’homme par rapport aux souris et il y a des tests comportements et toxicologiques conçus spécifiquement pour les rats. En outre, les lignes de rat transgénique plus deviennent disponibles qui peuvent être utilisées dans les études de transfert de gène AAV.

Méthodes sont détaillées expansive CNS transfert de gènes chez le rat et la quantification rapide et fiable des résultats. Transduction de CNS à grande échelle est utilisée pour imiter la symptomatologie de la SLA chez les rats en exprimant TDP-43 tout au long de la moelle épinière. La méthode est des injections de veine de queue du vecteur TDP-43 à jeunes rats adultes que celui utilisé dans Jackson et al. 6 , 8 , 9 après plusieurs semaines, les déficits moteurs induite par TDP-43 sont marqués par deux méthodes : échapper à réflexe et rotarod tel qu’utilisé dans Dayton et al. et Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 pour le vecteur GFP contrôle, dans l’analyse post-mortem, la zone fluorescente du cervelet est calculée comme un indice d’efficacité de transduction utilisé dans Jackson et al. 6 , 8 l’analyse du cervelet s’est avéré pour être un index rapid et fiable du degré de transduction CNS après la livraison de gène périphériques et devrait s’appliquer à une variété d’approches tentative de transfert de gènes de centre-à-périphérique.

Protocol

toutes les procédures suivies les directives appropriées du NIH. Toutes les procédures suivies des protocoles d’animaux qui ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à LSU Health Sciences Center à Shreveport et animalier. Rats Sprague-Dawley femelles à l’âge de 6 semaines ont été utilisés pour cette procédure. 1. déterminer les doses/volumes du vecteur nécessaire peser les rats à doser et déterminer la quantité de vecteur viral nécessaire pour chaqu…

Representative Results

TDP-43 induit une déficience moteur devrait se produire au sein de 2 à 6 semaines selon la dose de l’AAV TDP-43 utilisée (Figure 1). Les injections de veine de queue infructueuse entraînera partielle ou aucune déficience ; l’AAV doit atteindre la circulation sanguine pour produire l’effet. Une injection réussie d’AAV GFP se traduira par l’expression de la GFP dans le cerveau et la moelle épinière dans une façon vector-dose-dépendante. Lor…

Discussion

Une variété d’itinéraires de livraison ont été testés pour des vecteurs d’AAV : intra-parenchymateux, intra-cérébroventriculaire, intra-thécale, par voie intraveineuse, par voie nasale, intramusculaire, etc. Chaque itinéraire peut avoir des avantages spécifiques, mais aussi des inconvénients. Administration de queue veine de VAA à des rats adultes est une méthode fiable pour la réalisation de transduction cohérente du SNC. La méthode d’injection périphérique permet d’éviter l’introduction d…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par l’ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx et un don de charité pour la recherche ALS de Thomas Lawson, pour lesquels nous sommes reconnaissants. Nous remercions yassine verger et Donna Burney de conseils et de formation. JAS a été soutenu par la Fondation menti et accorder des National Institutes of Health GM103418.

Materials

Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
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Citer Cet Article
Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

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