クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法
Summary
我々は、超遠心分離の必要性を排除した、架橋マウス骨格筋から高品質の核を単離するための濾過ベースのプロトコールを提示し、容易に適用することができる。本発明者らは、核から調製されたクロマチンが、クロマチン免疫沈降およびクロマチン免疫沈降配列決定研究に適していることを示す。
Abstract
クロマチン免疫沈降（ChIP）は、クロマチンDNAへのタンパク質結合を決定する強力な方法です。しかしながら、繊維が豊富な骨格筋は、筋原繊維の汚染を最小限に抑えた高品質の核の単離における技術的困難のために、ChIPの課題であった。以前のプロトコールでは、架橋前に核を精製しようと試みたが、これは核形成の延長過程でDNA-タンパク質相互作用の変化のリスクを招く。現在のプロトコールでは、まずマウスから採取した骨格筋組織を架橋し、組織を細かく砕いて超音波処理した。我々は超遠心分離が架橋筋肉組織を用いて筋原線維から核を分離することができないことを発見したので、重要な筋線維汚染のない高品質の核を得るために逐次濾過手順を考案した。その後、超音波装置を用いてクロマチンを調製し、抗BMAL1抗体を用いたChIPアッセイにより、遺伝子プロモーターを標的とするBMAL1のパターン。この濾過プロトコールは、架橋骨格筋組織から高品質核を単離するための簡単に適用可能な方法を構成し、概日および他の時間に敏感な研究のための一貫した試料処理を可能にする。次世代シークエンシング（NGS）と組み合わせて、本発明者らの方法は、骨格筋機能に焦点を当てた様々な機構およびゲノム研究のために配置することができる。
Introduction
骨格筋は生理および行動において重要な役割を果たす。多核筋繊維は、アクチンとミオシンが収縮力を発生させる筋節と呼ばれる機能単位を形成する筋原繊維からなる。骨格筋は体内で最大の代謝臓器でもあり、食後のグルコース摂取量が80％を超え、インスリン応答と代謝ホメオスタシスを調節します1,2 。筋肉の生理および代謝は、内在的な時計である内在的な生物学的タイマー3,4,5,6によって厳密に規制されている。例えば、概日の主要な時計成分の1つであるBmal1の骨格筋特異的欠損は、インスリン抵抗性をもたらし、骨格筋におけるグルコース取り込みを減少させ、動物は2型糖尿病を発症することが判明した7 。私さらに、骨格筋も内分泌臓器8として評価され、全身の代謝および生理機能を調節するためにミオシンを分泌する。骨格筋におけるこれらの調節機能を完全に理解するためには、機構的研究が必要である。
ChIPは、DNA結合タンパク質のプロモーター補充を描写するための強力なアプローチである。 ChIPは、最初にクロマチンDNA 9,10上のヌクレオソーム構成を同定するために開発された。ホルムアルデヒド、硫酸ジメチルまたは紫外線照射（UV） 11,12を使用してタンパク質およびクロマチンDNAを架橋する様々な方法が報告されている。ホルムアルデヒド架橋は、最も一般的に使用され、クロマチン構造およびDNA-タンパク質相互作用を保存している9,13,14。架橋クロマトグラフィーinを音波処理により細断し、目的の特定のDNA結合タンパク質15,16に対する抗体で免疫沈降させる。近年、ChIPとNGSを組み合わせたChIP配列決定法（ChIP-seq）は、ゲノム全体の転写因子結合を調べるために開発されており、場合によっては時間経過に伴う動的変化をモニターするために開発されている18,19,20 。例えば、概日ChIP-seq研究は、24時間の概日周期18にわたって時間的に正確な遺伝子発現を駆動する概日クロック成分およびヒストンマーカーのゲノム結合の高度に調整された配列を明らかにした。
最も入手可能なChIPプロトコルは、軟組織（ 例えば、肝臓、脳など ）用に設計されており、骨格タルマシン。繊維が豊富な骨格筋を均質化し、高品質の核21を分離することは技術的に困難であり、特に架橋を必要とするChIP実験の場合には困難である。最近の筋肉ChIP研究22では、衛星細胞を筋繊維から分離し、核を両方の細胞型から、組織消化を含む長期の手順によって調製した。ホルムアルデヒド架橋が単離された核の上で行われる前に、全工程が完了するまでに約3時間を要した。この手順は、筋肉組織をより効率的な均質化に対して不応性にし、高品質の核を生成することができた筋繊維の架橋を回避したが、組織の収集から核の架橋への有意なタイムラグは、 – タンパク質相互作用。対照的に、ほとんどの研究は、リアルタイムDNA-プロテイムを保存するために、実験的処置または組織回収の直後に架橋を行ったn結合12 。架橋前の核単離の第2の欠点は、典型的には3〜4時間間隔で生じる概日検体採取のような時間依存性の適用を排除することである。核を架橋させることなく、解離の直後に単離を進行させる必要があるのに対し、架橋した試料は時間経過全体が完了した後に一緒に処理することができ、実験の一貫性を保証する。
未架橋骨格筋からの核の単離のための他のプロトコールも報告されている。 2つの研究では、勾配超遠心分離を使用して残りの筋原線維および細胞破片から核を分離することが記載されている23,24 。スクロースまたはコロイド勾配超遠心分離が未架橋筋肉組織に有効である一方で、本発明者らの実験は、架橋後、勾配超遠心分離が細胞dから核を分離することができないことを明らかにしたエブリスはグラデーションに乗っています。
したがって、我々は、架橋マウス骨格筋組織を用いて高品質の核を単離するための手順を開発した。グラジエント超遠心分離ではなく、連続したろ過法を考案し、核を残骸から効果的に分離しました。超音波処理後、クロマチンサンプルは、標的プロモーターに結合するBMAL1タンパク質の概日パターンを示すChIP研究に首尾よく適用された。我々の方法は、筋肉組織の様々な機械的研究に広く適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、架橋された骨格筋組織を用いて高品質の核を単離する堅牢な方法について説明します。塵から核を効果的に分離するために逐次濾過を行い、皿状トランスデューサからの超音波エネルギーがChIP分析のためにクロマチンを剪断した。この結果は、標的プロモーターにBMAL1の概日特異的結合を示した。
ChIPは、架橋が起こるときにゲノムDNA上のリアルタイムタンパ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはKaryn Esser、Koike Nobuya、Park Noheon Parkに助けになることに感謝します。この研究は、NIH / NIGMS（R01GM114424）がS.-HYに、またRobert A. Welch Foundation（AU-1731）とNIH / NIA（R01AG045828）がZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
